梅花鹿Col X基因的RNAi重组慢病毒载体的构建及鉴定

【摘要】：研究十型胶原蛋白(Collagen type X,Col X),在软骨内成骨过程中所起的作用。本研究针对梅花鹿Col X基因设计筛选2条高分RNAi靶序列,在T4 DNA连接酶的作用下分别与慢病毒载体质粒plvthm连接,形成重组质粒S2-plvthm/S3-plvthm;PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。用Lipofectamine 2000介导S2-plvthm/S3-plvthm,pCMVdr8.91,pMD2G三质粒共转染293T细胞。结果显示:转染24小时后,观察到表达荧光蛋白的293T细胞。收集培养液后进行1000克离心力离心5分钟,所得上清液含有重组慢病毒的组分。S2-plvthm/S3-plvthm上清液中病毒滴度分别达到9.96×10~7TU/升和7.18×10~7TU/升。以此病毒感染梅花鹿角柄骨膜细胞,并进行微粒体培养,72小时后出现肉眼可见的白色微团,该细胞团有荧光表达。本试验成功地构建了针对梅花鹿Col X基因的慢病毒载体,为了研究Col X蛋白在鹿茸角骨化中的作用奠定了基础。