收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

CRISPR/Cas9单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质

陈易雨  王志平  倪汉文  许勇  陈其军  姜临建  
【摘要】:CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein9)系统因其高效、廉价、设计简单和用途广泛的特征正在改变基因编辑领域。但是对于植物基因工程而言,诱发定点突变依然是一个极大的挑战。近期,有人将胞嘧啶脱氨酶(CD)和糖苷酶抑制剂(UGI)分别融合到Cas9n(D10A)的N端和C端,借助融合蛋白实现了哺乳动物细胞内定点突变。Cas9n在sgRNA的引导下与靶标序列结合,释放出非sgRNA互补链的胞嘧啶碱基,遂作为Cas9n胞嘧啶脱氨酶融合蛋白的底物被催化,致使胞嘧啶碱基变成尿嘧啶。UGI与Cas9结合的目的在于抑制胞内的尿嘧啶DNA糖苷酶将U再催化回C。Cas9n会造成sgRNA互补链产生缺口,促使随后的DNA修复过程以完整链为修复模板,将U-G改变为U-A。DNA在复制或修复过程中将U-A错配变为T-A配对,产生想要的碱基编辑。为了实现这个新系统在植物体中的应用,我们合成了经过玉米密码子优化的CD-Cas9n-UGI(BE3),并将其特其构建入双元载体,用于拟南芥体内表达。双元载体转入农杆菌GV3101,再用蘸花法转染拟南芥后,用含有25 mg L~(-1)湖霉素的MS培养基筛选收获的种子,我们获得了的转基因植株,并且PCR检测单株植株的ALS基因后发现,240株T1代中检测出了4株发生C到T突变的植株,突变均发生在"脱氨基作用窗口",这4个株系含有杂合、嵌合或双等位基因突变。在一次转基因过程中,我们获得了四种氨基酸突变,T1代的C到T突变率约为1.7%。其中P197S和P197L会产生除草剂抗性是已知的,两个新的突变P197F和G202D同样具有除草剂抗性。通过进一步的实验证明,预期的除草剂抗性突变高效地遗传给了下一代,具有预期的苯磺隆除草剂抗性。另外,经除草剂处理后,我们从没被编辑过的T1株系得T2代中筛选找到了足量(约6%)的抗性籽苗。这说明,作为诱发定点突变的新工具,我们的碱基编辑系统具备强大的制造已知和未知突变的作用,在基础研究和作物改良上都有极大的利用价值。

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 胡文广,段淑芬;应用生物技术进行除草剂抗性育种[J];世界农业;1990年09期
2 李思经;;除草剂抗性作物的大田试验[J];生物技术通报;1990年05期
3 王国增;李轶女;张志芳;沈桂芳;;除草剂抗性基因的研究进展[J];生物技术进展;2011年06期
4 沈晶晶;李永丰;黄星;俞欣妍;何健;李顺鹏;;乙酰羟酸合成酶同工酶基因ilvBN、ilvGM和ilvIH的表达及对除草剂抗性的比较[J];生物工程学报;2009年07期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 朱晓磊;郝格非;戢风琴;杨光富;;除草剂抗性的分子机制研究[A];中国化学会第26届学术年会化学生物分会场论文集[C];2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978