松材线虫分子检测技术及其推广应用

【摘要】：根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F_(11)/R_(11)与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法。采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测。结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号。表明探针TaqMan-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性。此外,该检测方法非常灵敏,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005pg的松材线虫DNA含量;根据松材线虫RAPD特异片段,设计两对松材线虫特异引物(引物组合A与B),对枯死松树体内分离的184份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明,引物组合A与引物组合B分别对所有173份松材线虫株系均扩增出一条600bp、860bp的清晰、明亮的条带。而两对引物组合对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该两对引物均可以检测单条松材线虫。利用引物F_(11)/R_(11)与探针TaqMan-11构建了松材线虫实时PCR检测试剂盒,利用引物组合A与B构建了松材线虫SCAR标记检测试剂盒。采用这两种检测试剂盒可以在较短时间内对线虫进行鉴定。试剂盒的推广对松材线虫病的检疫工作有着重要的意义。2004年至2008年,应用SCAR标记技术与实时PCR技术先后对江苏、浙江、江西、湖北、重庆、四川、贵州等十四个省、市的500多个可疑松木样品进行了检测。松材线虫检测准确率达到100%。包括成功准确地检测鉴定了湖北某市的松材线虫,庐山风景区的拟松材线虫,重庆、贵州、福建、四川、山东等省的多个新的疫点市、县。该项技术是目前唯一能够大量应用于实践的松材线虫分子检测技术。