农杆菌介导的紫茎泽兰的遗传转化

【摘要】：紫茎泽兰是一种入侵性很强的恶性杂草,已经对我国农牧业生产以及森林和农田等生态系统造成了严重危害。目前,从分子水平对其化感作用调控机理的研究开展的还很少,遗传转化体系的建立将为其代谢调控途径中的关键基因的功能注释提供一个研究平台,从而为这种恶性杂草的综合治理提供理论基础。本研究通过对紫茎泽兰叶片、茎段、叶柄等不同的外植体愈伤组织诱导的难易程度的筛选,对农杆菌菌液的侵染浓度、侵染时间,对培养基不同激素配比以及抗菌素和抗生素有效浓度等条件的摸索,建立了一套简单而有效的紫茎泽兰的遗传转化方法。将茎段外植体在MS培养基上预培养1天,然后与带有pBI121质粒的农杆菌菌株LBA4404共培养3天,之后将他们转移到带有1.0mg l~(-1) NAA,1.0mg l~(-1) 6-BA,150mg l~(-1) Kan和200mgl~(-1) Cef的MS培养基上进行愈伤组织的诱导,10-15天继代培养一次,大约3-4周可以观察到茎段长出淡绿而硬质的愈伤组织,将这些愈伤组织转移到带有1.0 mg l~(-1) NAA,1.0 mg l~(-1) 6-BA,150 mg l~(-1) Kan和200 mg l~(-1) Cef的MS培养基上进行分化的诱导,大约6-8周以后,可以观察到胚性愈伤上面分化出来的小芽,待这些抗性芽长到1cm左右时,将它们转移到带有150 mg l~(-1)Kan,200 mg l~(-1) Cef的1/2 MS培养基中,约4周后可以得到生根的转基因幼苗。通过PCR和GUS组织化学染色,以及RT-PCR等方法的检测,表明外源基因已经整合到紫茎泽兰的染色体组中去了,转化频率可以达到2%。