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产几丁质酶菌株L03的种类鉴定及其几丁质酶研究

李世俊  张清霞  徐敬友  纪兆林  童蕴慧  
【摘要】:几丁质酶可以降解真菌细胞壁,从而抑制真菌生长,因此能分泌几丁质酶的微生物可以作为生防菌加以研究和利用。由作者筛选的L03菌株能分泌几丁质酶,其活性为0.702U/mL。经16S rDNA序列测定与Blast比对,该菌株与中华根瘤菌属等细菌的相似性达97%;结合菌株生理生化性状分析,认为L03为中华根瘤菌属细菌(Sinorhizobium sp.)。对L03菌株产生几丁质酶的条件进行了优化。用均匀设计方法在5个因素、6个水平上设计试验方案,试验数据用DPS软件分析,得出最佳的培养方法为:最佳碳源为7%胶体几丁质,最佳氮源为2%酵母浸出液(培养基其他成分:0.15%NaNO_3,0.05%MgSO_4·7H_2O,0.3%KH_2PO_4,0.015%FeSO_4·7H_2O),培养基pH值为7.8,培养温度为28℃,培养时间为6d。L03菌株代谢的几丁质酶能够用90%饱和度的硫酸铵沉淀,沉淀物经脱盐后分步层析。先进行Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,分离出7个蛋白峰,其中仅有峰4具几丁质酶活性:将峰4蛋白再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析,得到10个蛋白峰,其中峰5蛋白能降解几丁质;峰5蛋白经Sephadex G-75凝胶过滤层析后有3个蛋白峰,峰1具有酶活性,为L03菌株产生的几丁质酶蛋白。收集几丁质酶蛋白,对其进行SDS-PAGE电泳,得出该蛋白分子量为41.3kDa。L03菌株几丁质酶的酶学性质为:酶反应的最适温度为40~45℃;最适pH为6;酶液用40℃以下温度处理1h,活性基本相似,50℃处理活性明显下降;酶液在pH5~7条件下处理1h,活性基本不变;有些金属离子能增加酶活性如Mg~(2+)与Ba~(2+),有些则能抑制酶活性,如Na~+、K~+、Ca~(2+)、Fe~(3+)、Zn~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)等。L03菌株几丁质酶对多种重要植物病原真菌的细胞壁有较强的降解作用,包括水稻纹枯病菌、水稻恶苗病菌、小麦纹枯病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌、苹果炭疽病菌等。用酶液处理病菌,一般都能使菌丝出现细胞壁模糊、颜色变淡现象,甚至还能导致有些病菌菌丝细胞畸形或菌丝体完全崩解(光学显微镜观察)。

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