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彩色马蹄莲细菌性软腐病菌的鉴定及其群体感应淬灭的研究

谷春艳  钱国良  杨雪  胡白石  范加勤  刘凤权  
【摘要】:彩色马蹄莲是近几年在国内外推出的中高档花卉,被公认为21世纪的"花卉之星",但彩色马蹄莲细菌性软腐病发生严重,且没有理想的防治对策,极大阻碍了彩色马蹄莲在各地的发展。本研究从不同品种的彩色马蹄莲病组织中分离到6个菌株,经形态特征与培养性状比较、生理生化测试、16S rDNA序列分析和致病性测定,结果表明6个分离物均为胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora)。此外,信号分子检测试验表明,分离菌株可产生并释放出N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子。为了防治该病害,本研究利用信号分子干扰技术,通过群体感应淬灭酶(ATTM解脂酶),降解病原菌产生的N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)类信号分子,降低病原菌在马蹄莲上的致病性,从而达到防治该病害的目的。在研究中,我们一方面利用PCR技术扩增土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中的attM基因,将其克隆到载体pUC19上,转化宿主菌DH5α,构建工程菌株DH5α/pUCM,利用pUC19中的P_(1ac)启动子表达attM基因;另一方面利用PCR技术,扩增大肠杆菌JM109中的组成型表达的强启动子P_(1pp)。随后通过重叠PCR,分别将P_(1pp)启动子与水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)JXOⅢ中的hrf1基因和信号分子淬灭基因attM连接,连接于表达载体pUC19,构建工程菌JM109/pPHA,最终利用启动子P_(1pp)分别表达hrf1基因和attM基因。通过烟草过敏性反应,解酯酶AttM对病原菌信号分子降解作用的检测、以及attM基因编码的解酯酶AttM对彩色马蹄莲软腐病菌菌体生长和致病性的测定实验,表明:(1)自A.tumefaciens中获得的attM基因,在P_(1ac)启动子下,在大肠杆菌中可以有效地表达并产生AttM(AHL降解酶),降解病原菌的信号分子:(2)在表达载体pPHA中,P_(1pp)启动子能同时有效表达attM基因和hrf1基因,可以引起烟草过敏性反应,同时高效降解病原菌的信号分子;(3)AttM解酯酶不影响彩色马蹄莲软腐病菌的菌体生长,但可以通过降解AHLs,影响软腐病菌的致病性,在活体和离体条件下可有效地减弱该病原菌的致病性。利用P_(1pp)启动子表达attM基因和hrf1基因,防治效果更加理想,不仅可以有效防治马蹄莲细菌性软腐病,还能促进植物本身生长,为有效防治彩色马蹄莲细菌性软腐病提供了一种新途径。

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