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NADPH氧化酶在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

刘小贤  于健宁  马纪林  
【摘要】:目的:探讨NADPH氧化酶在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)转分化中的作用。方法:体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24h后,随机分为以下4组:正常对照组、TGF-β1(10ng/m1)刺激组、TGF-β1(10ng/m1)+DPI(NADPH氧化酶抑制剂,10μM)组(DPI预处理1h)、DMSO(DPI溶媒)组,用TGF-β1(10ng/m1)刺激RPMC不同时间,检测NADPH氧化酶亚单位p67phox及活性氧(ROS)的表达;观察α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),E钙黏素(E-cadherin)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)的表达。用荧光探针(DCF)检测细胞内ROS的产生;RT-PCR法检测p67phox、E-cadherin、α-SMA和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测p67phox、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ表达。结果:(1)经TGF-β1(10ng/ml)刺激后,NADPH氧化酶亚单位p67phox mRNA的表达逐渐增加,8h为对照组的2.20倍(P0.01),24h达3.89倍(P0.01);TGF-β1刺激10min即可明显增加细胞内ROS的产生,DPI预处理后,可明显抑制TGF-β1诱导的细胞内ROS产生。(2)RT-PCR结果显示,TGF-β1刺激后,α-SMA mRNA表达逐渐增强,至24h时为对照组的2.63倍(P0.01)。Western blot结果进一步证实,TGF-β1可明显增加α-SMA蛋白的表达,随着时间的延长,蛋白表达逐渐增加。DPI预处理后,TGF-β1诱导的α-SMA蛋白的生成明显受到抑制,较单纯TGF-β1刺激组下降了18.8%(P0.05)。DMSO对α-SMA的表达无显著作用。(3)RT-PCR结果显示,经TGF-β1刺激后,E-cadherin mRNA的表达逐渐降低,从8h开始,24h下降到0h组的36.98%(P0.01)。Western blot结果显示,TGF-β1可显著降低E-cadherin蛋白的表达,与基因水平相一致。DPI组TGF-β1诱导的E-cadherin的下调得到改善,较TGF-β1组上调了32.97%(P0.05)。DMSO对E-cadherin的表达无显著作用。(4)RT-PCR结果显示,TGF-β1可明显增加Col I mRNA的表达,与TGF-β1组比较,DPI组ColⅠmRNA的表达明显受到抑制,下降了30.00%(P0.05)。Western blot结果也显示,DPI可明显抑制ColⅠ蛋白的表达,较单纯TGF-β1刺激组下降了40.05%(P0.05)。结论:(1)TGF-β1可刺激RPMC NADPH氧化酶亚单位p67phox表达上调及增加细胞内ROS的产生,同时诱导RPMCα-SMA、ColⅠ的上调表达及E-cadherin的下调表达;(2)抑制NADPH氧化酶活性可部分逆转TGF-β1诱导的RPMC转分化。

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