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肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷类抗生素基因aac(3)-Ⅰ的改构与功能研究

查长森  王震  陈云波  吕建新  
【摘要】:目的研究氨基糖苷乙酰转移酶基因aac(3)-Ⅰ碱基变异与功能的关系。方法构建重组表达载体pET、28-aac(3)-Ⅰ,转化感受态E.coli BL21(DE3),经含终浓度为25μg/ml的Kan抗生素LB平板筛选得到阳性克隆并酶切验证后送大连宝生物测序,测序结果与NCBI登录的序列号为AF282595经 Blast比对分析100%同源。然后在体外对aac(3)-Ⅰ基因进行易错PCR改造,以同样的方法构建重组表达质粒,转化感受态感受态E.coli BL21(DE3),经乙酰转移酶AAC(3)-Ⅰ的底物(庆大毒素)筛选到一株阳性克隆,经鉴定后送用大连宝生物测序。以琼脂稀释法检测不同克隆株的MIC值。结果通过底物(庆大霉素)筛选得到一个克隆株,测序后发现7处碱基变异,其中C76T、C272T、T373C引发了相应氨基酸的变化,分别对应是:26位氨基酸由Arg→Cys;91位氨基酸由Ser→Phe;125位氨基酸由 Thy→His。突变后的基因表达载体转化菌AAC(3)-Ⅰ酶活性下降明显,将此序列提交 ESypred3DWebServer1.0,经spdbv软件进行三维空间结构预测。结论 aac(3)-Ⅰ基因发生突变的的这三个氨基酸位点是AAC(3)-Ⅰ活性重要相关位点。

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