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酿酒酵母ADH3基因的敲除

宋浩雷  郭晓贤  杨月梅  江贤章  黄建忠  
【摘要】:能源是人类赖以生存和发展的关键因素,燃料乙醇作为石油能源的替代物,逐渐成为世界各国研究的热点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种已知全序列的重要模式生物,具备单双倍体特性、乙醇耐受性强、高效体内重组的能力、可操作性强等优点,因此它在基因操作和生物能源方面是首选的研究对象。同时酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株,其乙醇生产能力主要取决于乙醇合成与分解代谢的动态平衡。乙醇脱氢酶是酿酒酵母乙醇代谢分解的关键酶。敲除编码乙醇脱氢酶的基因可有效地降低酵母的乙醇分解代谢活性,提高酵母细胞合成乙醇的能力。以PCR为基础的基因敲除方法,尤其是loxP-Marker-loxP序列组件和Cre/loxP系统准确易行,已被广泛应用于酵母功能基因的分析。利用酿酒酵母同源重组机理应用这种方法敲除影响乙醇产率相关目的基因,可以实现提高酿酒酵母产乙醇能力。本文利用Cre/loxP系统和Kanr(卡那)筛选标记,建立了ADH3基因敲除的技术方法,获得ADH3基因缺失的酿酒酵母突变株YS3-ADH3。设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母 YS3(Saccharomyces cerevisiae),利用酿酒酵母体内同源重组机制敲除其体内双倍体基因其中的一个基因,PCR验证筛选阳性克隆子。随后将质粒pSH47转入阳性克隆子。乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr筛选标记基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH47质粒,在原目的基因ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次转化构建带有Cre/loxP系统的敲除组件敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。试验结果表明:与其他传统基因破坏方法相比,以PCR为基础的基因破坏方法能够避免繁琐的基因克隆操作,省时、省力、方便。

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