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扩展青霉脂肪酶基因在酿酒酵母中的表达

李生强  林琳  
【摘要】:扩展青霉(Penicillium expansum)PF898可产生一种具有重要工业生产价值的碱性脂肪酶 (PEL),在克隆PEL基因的基础上,本研究将PEL成熟肽基因lip及带有自身前导肽的基因lip07分别连接到酿酒酵母表达载体,构建了重组质粒pVT102U/α-lip、pVT102U/α-lip07,并分别电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeS78,构建了重组菌株S78-pVT102U/α-lip及S78-pVT102U/α-lip07。发酵表达的结果表明lip及lip07在S78中均成功获得了分泌表达,表达产物分泌到培养基中,分子量约为 28kDa,与天然扩展青霉脂肪酶的分子量基本一致。重组酵母S78-pVT102U/α-lip摇瓶发酵产物可在橄榄油平板上和三丁酸甘油酯平板上形成透明圈,发酵酶活为20.0 U/ml。而S78-pVT102U/α-lip07的发酵酶活低,表达的脂肪酶不能在橄榄油平板上形成透明圈,仅能在三丁酸甘油酯平板上形成透明圈。可见,在已有α因子信号肽的基础上,自身前导肽的引入影响了脂肪酶的正确折叠和分泌,这与Rhizopus oryzae脂肪酶基因在酿酒酵母中的表达不同,具体原因尚需进一步研究。为提高PEL成熟肽基因lip在酿酒酵母中的表达量,本研究从移种量、培养基pH、碳源及培养基组成等方面对S78-pVT102U/α-lip进行初步的发酵条件优化,结果表明:适宜的培养基组成为3.0%酵母抽提物、3.0%胰化蛋白胨、2.0%蔗糖。适宜的移种量为1.3%,起始pH为7.0,28℃摇瓶发酵时间为 72h。通过优化培养基,发酵液酶活可达56.0 U/ml,是优化前的2.8倍。本研究建立的PEL成熟肽基因 lip在酿酒酵母中的活性表达体系为该脂肪酶的定向进化研究等打下了基础。

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