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纳米探针检测新技术及其在蓝舌病病毒检测中的应用

尹惠琼  贾茗娴  王蕊  杨姝  王升启  章金刚  
【摘要】:目的生物条形码检测技术(Bio-barcode assay,BCA)是2003年出现的用于微量蛋白检测的新技术。该技术是利用纳米金颗粒制备免疫检测探针,以实现对微量蛋白的高灵敏度检测,其检测过程是利用纳米金标记检物多克隆抗体和2条互补的DNA链(标记DNA链和条形码DNA链)制备纳米金探针(NP),其中1条单链为条形码DNA,利用磁性微球标记被检物单克隆抗体制备磁球探针(MMP),可形成NP-被检物-MMP三明治复合物,磁场分离,洗脱释放NP上的单链条形码DNA进行PCR或银染检测,此方法对蛋白的检测灵敏度为ELISA方法的106倍。本研究在传统BCA技术的基础上,对其进行了技术改进,旨在建立纳米探针检测新技术,并将其初步应用于蓝舌病病毒检测中。方法将NP探针上的双链DNA换为单链条形码DNA链进行标记,并直接利用基于TaqMan探针的荧光定量PCR技术对三明治复合物上的单链条形码DNA链进行检测,进而建立了新型纳米探针检测技术,利用此新型检测方法对蓝舌病病毒VP7蛋白进行检测。结果这一新型检测方法不仅简化了传统BCA中的探针制备程序和条形码DNA的检测程序,而且荧光定量PCR技术的引入,进一步提高了检测的灵敏度和准确度,避免了常规PCR容易产生的气溶胶和假阳性等问题。检测灵敏度达到10-2fg/ml,比传统BCA法的灵敏度提高了10倍。利用不同血清型蓝舌病病毒及其亲缘关系最近的鹿流行性出血热病毒进行的特异性试验结果表明,该技术的检测特异性良好,与相关病毒无交叉反应。利用蓝舌病病毒VP7蛋白进行重复性试验,结果表明,批间变异系数5%,检测体系具有良好的重复性。利用上述建立的纳米探针检测技术对动物样品进行检测,同时设蓝舌病病毒核酸荧光RT-PCR检测技术、蓝舌病病毒抗原捕获ELISA检测技术作为对比方法,结果显示,纳米探针检测技术与荧光RT-PCR检测技术有良好的检测一致性,抗原捕获ELISA检测方法的灵敏度低于纳米探针检测方法和荧光RT-PCR检测方法。结论本研究建立的新型纳米探针检测技术为痕量蛋白的超灵敏检测提供了一种简便的新方法,也为进一步研制纳米探针检测试剂盒奠定了理论和技术基础。

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