建立FQ-PCR体系定量检测新型隐球菌CAP10 mRNA及其应用
【摘要】：目的建立荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)体系定量检测新型隐球菌(cryptococcus neoformans,CN)的荚膜相关蛋白10(capsule associated protein10,CAP10)基因mRNA,探索将其用于新型隐球菌感染诊断的可能性。方法用逆转录PCR从CN标准株(ATCC34874)中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准曲线;建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价;利用建立的FQ-PCR体系检测20例患者抗真菌药物治疗前后脑脊液(cerebrospinalfluid,CSF)CAP10 mRNA拷贝数的变化。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10。建立的FQ-PCR体系的批内CV值为0.31%,批间CV值为2.73%,特异扩增新型隐球菌,线性范围为10~1copies/μl～10~8copies/μl。治疗前CAP10 mRNA(拷贝/μ1.个)log值为1.28±0.82,治疗后CAP10 mRNA(拷贝/μ1.个)log值为0.75±0.86,治疗前明显高于治疗后(P0.05)。结论构建的新型隐球菌CAP10 mRNA的FQ-PCR定量检测体系重复性好,特异性强,适合于脑脊液标本的检测,为新型隐球菌感染的诊断提供了依据。
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