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突变podocin通过TRPC6介导的钙离子内流诱导足细胞损伤

范青锋  张涵  刘淑芳  余自华  管娜  邢燕  丁洁  
【摘要】:目的足细胞裂孔隔膜在肾小球虑过屏障中起关键作用。Podocin分子作为裂孔隔膜复合体的"组织者"对其他裂孔隔膜分子如nephrin和CD2AP的锚定起重要作用。我们研究组发现了首例汉族家族性局灶节段性肾小球硬化家系存在NPHS2复合杂合突变,其分别引起编码蛋白podocin在第165位氨基酸截断(V165X)和第168位精氨酸变成组氨酸(R168H)。目前尽管报道了许多NPHS2突变,但是突变podocin导致足细胞损伤以及蛋白尿的分子机制并不清楚。与蛋白尿发生有关的首个足细胞离子通道蛋白TRPC6的发现及其与podocin存在共定位和共沉淀关系为我们深入探讨突变podocin的致病机制提供了新的思路。TRPC6为Ca2+相关蛋白,突变的TRPC6可增加血管紧张素Ⅱ诱导的Ca2+内流,而胞内游离Ca2+增加将引起细胞的损伤。本研究欲通过探讨突变podocin引起的足细胞损伤过程中对TRPC6、nephrin和CD2AP表达与分布,以及胞内游离Ca2+水平的影响来阐明TRPC6在突变podocin致足细胞损伤的可能作用。方法1.构建含有V165X或R168H的表达载体,并分别转染体外培养的正常以及TRPC6"敲低"的足细胞。2.通过流式细胞术用FITC-Annexin V凋亡试剂盒评价突变podocin对足细胞的损伤。3.利用免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察TRPC6、nephrin和CD2AP的分布变化。4.通过免疫蛋白印迹评价突变podocin对TRPC6、nephrin和CD2AP表达的影响。5.通过免疫共沉淀揭示突变podocin与TRPC6的相互作用改变。6.通过胞内游离Ca2+指示剂Fluo-3AM用荧光光谱仪FLX800检测胞内游离Ca2+水平的变化,并观察突变podocin转染细胞对TRPC6激动剂OAG(100μM)和胞外Ca2+(2mM)刺激的反应。结果1.这两个突变podocin均能显著引起足细胞损伤,表现为凋亡和死亡细胞比例明显增高。2.正常podocin主要沿胞膜分布,V165X可部分定位于胞膜,而R168H呈颗粒状仅位于胞核周围:重要的是V165X和R168H仍与TRPC6、nephrin和CD2AP保持共定位和共沉淀。3.R168H明显增加TRPC6、nephrin和CD2AP的表达,而V165X仅显著增加CD2AP的表达。4.在R168H转染足细胞检测到较强的胞内游离Ca2+荧光。OAG刺激后,胞内游离Ca2+的增加(反映钙库的释放)在V165X转染足细胞最为明显;继之加Ca2+刺激后,R168H转染引起了胞内游离Ca2+的显著增加(反映Ca2+的内流)。5.V165X转染细胞胞内细胞骨架明显消失,R168H转染细胞胞内细胞骨架排列明显紊乱,表现为聚集和消失。6.单纯TRPC6敲低不影响足细胞的凋亡和podocin的表达以及胞内游离Ca2+水平。在V165X转染足细胞,TRPC6的敲低明显减少了足细胞的凋亡以及胞内游离Ca2+水平;而TRPC6的敲低不影响R168H转染足细胞的凋亡以及胞内游离Ca2+水平。结论这两个突变podocin均引起了胞内Ca2+水平的增加和足细胞的损伤,其中V165X是通过TRPC6途径介导的钙库释放,而R168H可能是通过其他离子通道(TRPC6的异常分布引起的)诱导了胞外Ca2+内流。而胞内Ca2+增加可能导致了细胞骨架的重排以及其他裂孔隔膜分子表达和分布的改变。

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