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应用原位PCR检测母体循环中胎儿血红蛋白γmRNA的表达1

汤冬玲  周新  李艳  郑芳  李从荣  鲁敏翔  
【摘要】:目的原位PCR是一种直接在细胞或组织材料标本上原位扩增目的DNA或RNA片段。并在原位检测扩增产物,从而进行细胞内特定核酸序列检出及定位的分子技术。胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin,HbF)(α2γ2)是胎儿红细胞中一种主要的胞浆蛋白,依据其特有的发育规律,拟从转录水平的角度。采用高灵敏度的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)结合原位杂交技术,深入探讨胎儿血红蛋白γmRNA在孕妇外周血中的表达机理。方法取EDTA抗凝的孕妇静脉血5 ml,PBS稀释后.经淋巴细胞分离液分离获取单个核细胞层。PBS洗3次.离心后将沉淀涂片在经多聚赖氨酸处理的载玻片上,10%缓冲中性甲醛固定,PBS洗3次,蛋白酶K消化。PBS洗3次,气干。用地高辛标记的脱氧三磷酸尿苷掺人的原位RT-PCR的方法进行检测.经25轮PCR循环后.用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体检测扩增产物.显色镜检。分析36例孕妇外周血中胎儿血红蛋白γ基因的表达情况。结果靶序列的原位RT-PCR结果显示.36例孕妇外周血中有30例标本中可定位检测到胞核、胞浆内的蓝紫色的阳性信号。符合率为83.33%.在孕妇外周血和初产妇的脐血的有核红细胞的胞浆内均可检测到DIG标记的HbF-γmRNA蓝紫色信号。而正常人外周血则无此信号。结论原位RT-PCR将PCR技术的高效扩增与细胞定位相结合,在细胞原位检测低拷贝mRNA,具有敏感性高、特异性强的特点.能从分子水平上定位定量检测HbF-γmRNA的表达,该基因仅在孕妇外周血中表达,未孕女性未见其表达.提示HbF-γmRNA可能为孕妇外周血中的一种新的靶标.为无创性产前诊断提供线索和思路.

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