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单核细胞中颗粒溶素的免疫激活作用

陈燕  周晔  陈波  蒋廷旺  吴传勇  邓安梅  仲人前  
【摘要】:目的探讨颗粒溶素的免疫激活作用。方法:①将编码颗粒溶素的cDNA克隆至pET28a(+)vector(Novagen)并转入大肠杆菌BL21中表达。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达3小时后,收集包涵体蛋白。变性后经Ni2+柱纯化重组蛋白,经复性、透析、HPLC柱纯化后得到颗粒溶素蛋白,经检测其内毒素水平低于1.0 EU/μg颗粒溶素。②于5%C02、37℃条件下.RPMI 1640中培养U937细胞,将100 ng/ml PMA加入U937细胞中,两天后.加入不同组合的LPS、LTA、颗粒溶素,刺激培养4h后收集细胞,用ELISA法测TNF-α的含量。③在U937细胞或原代单核细胞中加入颗粒溶素后,在37℃条件下。刺激4小时,收集上清.以ELISA法分析MCP-1和RANTES的含量;收集细胞后,实时荧光定量RT-PCR方法检测颗粒溶素刺激培养U937单核细胞后的部分基因表达水平的改变。结果:①加入颗粒溶素后,LPS诱导的TNF-α水平增加(P0.05)。②经颗粒溶素刺激后.上清液中MCP- 1和RANTES水平均增加(P0.05)。荧光定量PCR方法检测后,U937细胞或单核细胞表达MCP-1、RANTES的mRNA水平也显著增加(P0.05)。结论:我们实时荧光定量RT-PCR方法,对颗粒溶素使单核细胞和U937细胞产生MCP-1和RANTES的效应做了评价。在颗粒溶素存在下,培养的单核细胞和U937细胞产生MCP-1和RANTES有显著性意义.低浓度(10nM)的颗粒溶素可使单核细胞和U937细胞产生的MCP-1和RANTES增加3-10倍.然而高浓度的颗粒溶素(微摩尔)才能使LPS刺激的单核细胞产生TNF增加2倍。总之.这些数据表明颗粒溶素的局部浓度对于其生物活性非常重要.高浓度可引起其细胞毒活性而离颗粒溶素释放部位较远的低浓度颗粒溶素.能活跃地招募免疫细胞到炎症部位。

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