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大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选

张方  施毅  辛晓峰  宋勇  赵明  李子玲  钱桂生  罗向东  
【摘要】:正构建脂多糖(LPS)和地塞米松(DEX)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库,探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子。采用LPS(10 mg/ml)和DEX(10-5 mol/L)作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4小时后,从肺泡巨噬细胞中提取总RNA,再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo (dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的双链cDNA,后者纯化后,与线性质粒pGADT7- Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中同源重组成环行的有复制活性的cDNA文库质粒, 收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆,即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pG-

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