Nurr1短发夹RNA表达载体的构建及其对多巴胺能细胞中内源基因的干扰作用

【摘要】：目的:构建小鼠核受体相关因子1(Nurr1)shRNA的真核表达载体,并检测其对多巴胺能细胞系MN9D中内源基因的干扰效果。方法:选择两段RNA干扰靶序列,合成两对编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到 pSilenCircle载体中,构建含目的基因片段的重组质粒Nurr1-shRNA1和Nurr1-shRNA2。以同样的方法,构建无关基因P53 的重组质粒P53-shRNA。以脂质体LipofectamineTM 2000转染上述重组载体至多巴胺能细胞株MN9D中,以RT-PCR和 Western blot方法检测48小时后Nurr1-shRNA对Nurr1基因表达的影响。结果:利用Stu Ⅰ酶切鉴定重组载体后,DNA测序证实合成的siRNA基因序列正确并已被准确克隆入pSilenCircle载体。与P53-shRNA相比,Nurr1-shRNA载体可特异性抑制MN9D细胞中Nurr1的表达,其中Nurr1-shRNA1的抑制效果比Nurr1-shRNA2明显。结论:Nurr1特异性shRNA 表达载体的成功构建,为多巴胺能神经元发育以及帕金森病相关基因的功能研究奠定了基础。