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A2McDNA片段修饰的神经干细胞与Aβ作用的实验研究

刘之荣  
【摘要】:目的:将pEBFP/FP6重组子转染进神经干细胞,探讨pEBFP/FP6修饰的神经干细胞能否结合、拮抗Aβ1-42的毒性。方法:①分离胚胎大鼠皮层神经前体干细胞,Anti-Nestin、GFAP、Gal、MAP-2进行免疫组织化学鉴定。②采用脂质体转染方法将FP6-pEBFP转染进培养的神经干细胞中,利用其所携带的绿色荧光蛋白、流式细胞仪和RT-PCR方法进行 FP6-pEBFP的表达分析。③利用相差显微镜及绿色荧光蛋白观察携带FP6-pEBFP基因的神经干细胞其生长、增殖、分化情况。④将FP6-pEBFP修饰的神经干细胞与不同浓度的Aβ1-42共同培养,相差显微镜观察细胞形态,并进行细胞存活率的MTT法比色分析检测和培养液乳酸脱氢酶检测。结果:①培养的细胞加入血清后,能诱导其分化,免疫组织化学鉴定均呈阳性表现。②用脂质体成功地将pEBFP/FP6重组子转染进培养的神经干细胞中,相差显微镜观察显示pEBFP/FP6修饰的神经干细胞其生长、增殖、分化未受影响。③相差显微镜观察,与对照组相比,pEBFP/FP6修饰的神经干细胞与Aβ1-42共同培养时形态较相对稳定。④Aβ1-42作用后细胞存活率的MTT法检测显示随作用时间延长,细胞存活减少。随Aβ1-42 浓度增高,细胞的损害加重。转染pEBFP/FP6重组子组MTT值在Aβ1-42处理后的多个时相点均显著高于同期正常对照或空载体组。⑤培养液乳酸脱氢酶检测显示不同浓度Aβ1-42作用后培养液中乳酸脱氢酶的随Aβ1-42浓度升高,LDH值也明显增大。转染pEBFP/FP6重组子组LDH值在Aβ1-42处理后的多个时相点均显著低于同期正常对照或空载体组。结论:①经血清诱导分化实验,免疫组织化学鉴定所培养的细胞为神经干细胞。②采用脂质体转染方法,将pEBFP/FP6重组子转染进神经干细胞中,相差显微镜观察和RT-PCR方法证实转染的神经干细胞能表达pEBFP/FP6融合蛋白。③相差显微镜观察、MTT法比色分析检测和培养液乳酸脱氢酶检测提示pEBFP/FP6修饰的神经干细胞较能耐受Aβ1-42的毒性。 pEBFP/FP6修饰的神经干细胞体系的建立,为A2McDNA的FP6区段在活细胞上的功能研究及其所修饰的神经干细胞移植治疗AD提供了可能。

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