实时荧光定量PCR检测腓骨肌萎缩症1A型基因重复

【摘要】：目的:近年来我们已先后建立起短串联重复序列分析(STR)和PCR酶切法检测特异性融合片段来诊断CMT1A 基因重复。STR结合银染的方法因有便宜、省时和所需DNA数量少等优点曾被广泛应用,但主要缺点是受杂合率的限制,如果被检测者为纯合子,则无法得出结论;而PCR酶切法的阳性率较低。因此,本研究的目的在于建立快速、敏感而稳定的检测腓骨肌萎缩1A型基因重复的新方法。方法:18例经短串联重复序列分析和/或PCR-双酶切法确诊的CMT1A病人,来自18个家系。其中,男性10人,女性8人,年龄8-48岁。对照组:20例年龄和性别相匹配的家系外正常对照。提取人类基因组DNA,普通PCR反应并测序,Real-time PCR反应分别扩增PMP22和人血浆白蛋白(ALB):以SYBR Green I荧光染料为标记物,采用标准曲线的相对定量方法检测正常对照、基因重复患者PMP22基因相对内源参照物ALB基因量的变化,每个样品重复3次。结果:PMP22和ALB基因PCR产物测序结果与标准序列完全一致;在PMP22和ALB的溶解曲线中未检测到引物二聚体和其他非特异性荧光信号;重复扩增的平均变异系数分别为4．8％和8．7％;标准曲线的斜率分别为-3．659和-3．508,相关系数均为 r=-0．99。在正常对照组,PMP22比率的变化范围0．83-1．2,而在CMT1A组PMP22重复变化比率为1．3-1．83,二者之间无重叠。结论:实时荧光定量PCR是近年来发展起来的一种快速、准确,且可重复性好的检测基因重复或缺失的新方法。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR Green I特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,所以可以通过检测反应体系中的SYBR Green I荧光强度来检测PCR产物的扩增量。本研究以 SYBR荧光染料为标记物,采用标准曲线的相对定量方法检测了20正常对照、18名基因重复的患者PMP22相对内源参照物ALB的量的变化。待测基因PMP22和内参照基因ALB的扩增曲线和标准定量曲线的斜率分别为-3．659和3．508,相关系数均为-0．99,提示PCR产物扩增的高效性。PMP22和ALB的PCR产物测序结果与各自的标准序列完全一致以及二者溶解曲线中未检测到引物二聚体和其他非特异性荧光信号,提示PCR产物高度的特异性。同一标本重复扩增后,PMP22和 ALB相对基因拷贝数的平均变异系数分别为4．8％和8．7％,提示本方法可准确检测二者的相对拷贝数。本研究中的18名 CMT1A患者都是以前用STR分析和/或酶切法证实有基因重复者。用正常对照分别做PMP22和ALB的标准曲线,样品稀释度分别为1:16、1:64、1:100、1:128和1:200,,检测样品时每次均要正常对照和空白对照,每个样品重复3次。通过标准曲线分别将PMP22拷贝数和ALB拷贝数相对定量后,将二者相比,即获得了PMP22基因的绝对拷贝数。在正常对照组,PMP22 比率的变化范围0．83-1．2,在CMT1A组PMP22重复变化比率为上限和下限分别为1．3-1．83,二者之间无重叠,证明该方法敏感而特异。总之,SYBR Green I的实时荧光定量PCR标准曲线法在检测PMP22基因重复时高度敏感、特异,重复性好,方便而且经济,可同时检测患者及其家庭成员,及时发现无症状携带者,对遗传咨询极有帮助。