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PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒的构建和体内分泌表达大分子蛋白经“鼻-脑”通路人脑的研究

吴昊  吴江  
【摘要】:目的:寻求将大分子蛋白类药物沿“鼻-脑”通路导入脑内的方法。探讨将大分子蛋白基因水平上经穿膜肽基因修饰,并用腺相关病毒作为基因治疗载体,通过滴鼻给药途径,感染鼻黏膜细胞,在鼻粘膜内分泌表达的经穿膜肽修饰的大分子报告蛋白沿“鼻-脑”通路入脑的可行性。为进一步研究大分子治疗蛋白经“鼻-脑”通路入脑发挥疗效奠定基础。方法: 1.应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因,酶切鉴定,并进行序列测定和分析。2.将GFP、穿膜肽Ant 及PBV220/信号肽NT4三基因片段用DNA连接酶相连,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取NT4-GFP-Ant 基因片段。3.将已构建的NT4-GFP-Ant融合基因,插人载体质粒PSSHG腺相关病毒载体中的EcoR I-BamH I位点,构建重组腺相关病毒载体质粒。用腺病毒辅助质粒Pfg140、包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞系,包装rAAV。经斑点杂交方法测定重组病毒滴度。4.昆明小鼠随机分两组,每组4只。分别滴鼻给予小鼠PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒和对照组PSSHG/GFP重组腺相关病毒,10ul/只鼻孔,每日一次,连续滴鼻5天。10日后处死小鼠,脑组织冰冻切片,共聚焦显微镜观测脑组织荧光情况。结果:1.GFP基因经DNA 测序与Genebank序列一致。2.NT4-GFP-Ant融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确。3.经酶切鉴定将融合基因成功转至 PSSHG载体中;斑点杂交测定病毒的滴度为3.36×109 PFU/ml。4.滴鼻PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒组可在鼻粘膜、嗅球、海马观测到荧光。其余脑组织未见荧光。而对照组PSSHG/GFP重组腺相关病毒鼻粘膜上可见荧光表达,嗅球、海马、其他脑组织未见荧光。结论:1.成功克隆绿色荧光蛋白(GFP)基因。2.成功构建具有穿膜功能的“NT4-GFP-Ant”融合报告基因。3.成功构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体,并成功包装较高浓度的重组病毒。4.通过动物实验,①验证了“鼻粘膜-嗅神经-嗅球”入脑通路。②证明鼻粘膜内分泌表达经穿膜肽修饰的大分子蛋白可沿“鼻-脑”通路入脑。

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