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胰岛素对血管平滑肌细胞表达诱导型环氧合酶的影响

李洪涛  吴宗贵  潘晓明  樊明  
【摘要】:目的旨在探讨高水平胰岛素(INS)对诱导型环氧合酶(COX-2)表达及其合成前列腺素的影响,及其在高胰岛素血症或胰岛素抵抗(IS)导致AS发生的炎性机制中潜在作用。方法(1)功胞培养和处理:参照赵三妹等介绍的方法,采用消化法原代培养大鼠VSMC。8—10代细胞接种于60mm培养皿以及24孔板中,生长至90%。融合后,以终浓度为10、100、500、1000mU/L的胰鸟素分别刺激6小时,100mU/L的胰岛分别刺激3、6、12、24小时。拟作RT—RCR的样本Trizol法提取细胞的总RNA备用。拟作western blot的样本用2XSDS凝胶加样缓冲液裂解细胞,收集于EP管中,超声粉碎,煮沸10分钟,-20℃冻存。拟作PGE2EIA的细胞以10、50、100、200、1000U/L的1NS刺激2、4、8、12、16、24小时,结束前1小时加入花生四烯酸(20μM),收集上清,离心后-80℃存放待测。(2)RT-PCT测定COX-2mRNA:提取细胞的总RNA后,按RT—PCRkit提供的方法进行,以GAPDH作为对照。反应条件分别为COX2:94℃预变性5分钟,然后94℃30秒,55℃30秒,72℃30秒循环35次,72℃延伸7分钟。GAPDH:94℃预变性5分钟,然后94℃30秒,55℃30秒,72℃45秒循环25次,72℃延伸7分钟;RCR产物10μl在2%琼脂糖凝胶上电泳后摄像。GIS-2010凝胶成像分析系统分析条带灰度,以同一样品的GADPH灰度校正得出COX-2灰度的相对值进行比较,实验重复四次。(3)Westernblot测定COX-2蛋白表达:细胞裂解液按照常规方法行SDS—PAGE电泳,转膜、依次加入兔抗鼠COX-2多克隆抗体(一抗,1:500),辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG二抗,1:1000),将滤膜浸入WestDura化学发光底物试剂溶液中反应5分种,将滤膜置于X光胶片暗盒中,曝光,显影,定影,烘干,摄片。计算机软件分析条带灰度,实验重复四次。(4)PGE2EIA测定COX-2活性:按照试剂盒说明进行操作,计算出标准曲线后,以不同吸光度对应于标准曲线的数值得出PGE2。浓度,以pg/ml·105 cell表示。结果(1)胰岛素对COX-2转录的影响:INS(100U/L)刺激VSMC后3小时可见COX-2mRNA表达,随着刺激时间延长,COX-2n~NA条带灰度增加(P0.01),表明INS以时间依赖方式增加COX-2 mRNA表达。不同浓度的胰岛素刺激细胞后,可见100、500和1000U/L的胰岛素可诱导COX-2表达,随着浓度升高,表达量也逐渐增加,其差异具有统计学意义(P0.01),这表明胰岛素以时间、剂量依赖方式刺激COX-2mRNA表达。(2)胰岛素对COX-2蛋白表达的影响:COX-2蛋白分子量72KD,Westernblot结果显示INS(100U/L)刺激后3、6、12、24小时均可见COX-2蛋白表达,随着刺激时间延长,COX-2蛋白条带灰度增加(P0.01),表明INS以时间依赖方式增加COX-2蛋白表达。IND刺激6小时后,10、100、500、1000U/L的INS可引起COX-2蛋白表达,随着刺激浓度延长,COX-2蛋白条带灰度增加(P0.01),表明INS以浓度依赖方式增加COX蛋白表达。(3)胰岛素对平滑肌细胞分泌PGE2的影响:PGE2EIA试剂盒测得PGE2正常值为24.5pg/ml×105cell。不同时间的。INS刺激后PGE2浓度为36.5±7.88~145.5±15.6pg/ml,不同浓度的INS刺激后PGE2浓度为30.0±3.3~155.7±16.7pWml,随着mS刺激时间延长和刺激浓度增加,VSMCPGE2的分泌量明显增加,表明INS以时间和剂量依赖的方式增加PGE2的产生(P0.01)。结论IS是促进AS病理机制发生、发展的重要因素,高mS血症是IS的作用环节之一。它能够刺激血管壁脂质合成而破坏内皮功能,通过mS受体或mS样生长因子的作用使平滑肌细胞增生,血管壁增厚;破坏纤溶系统;此外还可以通过活化核因子NF—LB,作用于TNF—n、IL-1、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等靶基因参与AS的形成。目前,IS是一种低水平炎症的观点已得到普遍认同,胰岛素抵抗动脉粥样硬化研究(1R_AS)发现糖耐量异常人群中,血中炎症标记物与空腹m3及mS前体水平呈正相关。环氧合酶(COX)是花生四烯酸(AA)合成前列腺素(PG)过程的限速酶,其产物包括PGD2、PGE2、PGF2、PGG2、PGH2、PG12、以及TXA2等,其中PGE2为炎症介质。现已发现存在两种形式的COX。本实验通过原代培养大鼠动脉SMC与INS共同孵育,观察INS对SMC表达和分泌COX-2的影响,结果显示INS在转录及翻译水平均可刺激COX-2表达,这种效应具有剂量和时间依赖性。同时INS以时间和剂量依赖的方式刺激VSMC合成PGE2。高浓度INS通过活化细胞内信号途径、或与其他的炎性细胞因子协同作用,使调节转录的核因子活化,进而引起COX-2的表达,COX-2表达后刺激细胞产生促进或抑制炎症反应的PG,而在炎症的调节机制中发挥作用。IS目前被认为是AS的等危症,二者都是低水平的炎症反应,COX-2及其促炎性PG、产物的作用可能是IS引起AS发生病理机制的一部分,而以COX-2为靶向的抗炎治疗将有可能逆转或抑制这一病理过程的产生和发展。

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