携带人胰岛素基因慢病毒载体转染脐带间充质干细胞的实验研究

【摘要】：目的:构建共表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin)基因的慢病毒载体,探讨其对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cellshUCMSCs)的转染情况,为今后组织工程脂肪构建与体内回植研究奠定基础。方法:采用DNA重组技术,将insulin基因克隆至带EGFP的慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP中,筛选阳性克隆,并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带目的基因的质粒pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP共同转染到包装细胞293T内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,纯化浓缩,测定重组病毒的滴度。取足月儿脐带以组织块培养法分离培养hUCMSCs,以不同感染复数(MOI分别为0,1,3,5,7,10,15,20)的重组慢病毒感染hUCMSCs,通过报告基因GFP的表达筛选其最适MOI;以最适MOI重组慢病毒感染hUCMSCs,应用QPCR及Westernblotting方法分别检测细胞中insulin基因及蛋白水平的表达情况。结果:成功构建了共表达insulin基因和EGFP基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并对其成功包装、纯化及浓缩,病毒滴度为1.3×108TU/ml。不同MOI的重组慢病毒感染hUCMSCs后,通过GFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为10,此时对细胞的转染效率可达到90%以上,QPCR结果表明感染组insulin mRNA基因表达阳性,未转染组为阴性;Western blotting检测证实转染组细胞内及上清液insulin蛋白表达阳性,未转染组均为阴性。结论:构建的携带insulin基因的重组慢病毒载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP可有效转染hUCMSCs而表达insulin蛋白。