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丹参抗肝细胞凋亡活性成分的高内涵筛选

闫秀川  沈丽  周滔  刘成海  
【摘要】:背景与目的:丹参具有抗肝损伤与抗肝纤维化的广泛药理作用。肝细胞凋亡在肝损伤与肝纤维化等肝脏病理中有重要作用。本研究拟以TNF-α诱导的肝细胞凋亡作为筛选模型,发现抗肝细胞凋亡的丹参活性成分,为阐明丹参抗肝损伤与抗肝纤维化的物质基础提供依据。方法:4个不同浓度的丹参化学成分(丹酚酸A,丹酚酸B,二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA,丹参酮Ⅰ,丹参素钠)与人正常肝细胞株HL-7702孵育24 h,Multiparameter Cytotoxicityl试剂盒染色,药物高内涵筛选分析设备Kinetic Scan Reader检测各成分的细胞毒性。选择低浓度(1μmol/L或0.2μg/ml)和中浓度(10μmol/L或2μg/ml)丹参化学成分与HL-7702细胞预孵育1 h后,采用放线菌素D(Actinomysin D,Act D)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)作用6 h诱导人肝细胞株HL-7702凋亡。应用Multiparameter Apoptosis 1试剂盒染色后,Kinetic Scan Reader检测,获取细胞图像,配套软件分析结果。丹酚酸B盐10 mg/kg预防用药3天后,脂多糖(LPS)联合氨基半乳糖胺诱导小鼠急性肝损伤模型,试剂盒检测血清ALT、AST,HE染色观察肝组织炎症病理,TUNEL染色观察肝细胞凋亡。结果:细胞毒性分析发现,除1000μmol/L的丹酚酸A、丹酚酸B和丹参素钠对细胞有明显毒性作用外,其它浓度及各浓度的其它成分无毒性作用。细胞凋亡分析发现,正常对照组细胞未发生凋亡;Act D和TNF-α可诱导HL-7702细胞发生凋亡,表现为细胞核减小(核固缩),线粒体物质异常增加;1μmol/L和10μmol/L的丹酚酸A、丹酚酸B预处理均能明显防止肝细胞发生凋亡,表现为防止细胞核固缩和线粒体物质异常增加。其它成分无明显抗细胞凋亡作用(表1)。以丹酚酸B盐示例,显示图像结果(图1)。体内实验证实,LPS/GalN诱导的模型小鼠血清ALT、AST水平明显升高,肝组织小叶结构严重破坏,广泛的肝细胞变性坏死,炎症细胞浸润明显;丹酚酸B盐能显著降低升高的血清ALT、AST水平,减轻LPS/GalN诱导的肝组织病变。(表2,图2)TUNEL染色显示,正常对照组肝组织鲜有肝细胞发生凋亡;LPS/GalN诱导的模型肝组织中可见大量广泛的肝细胞发生凋亡;丹酚酸B盐预防用药可明显减轻肝细胞凋亡。(图3)结论:基于细胞核和线粒体损伤的细胞高内涵筛选方法初步发现丹酚酸A、丹酚酸B有良好的抗肝细胞凋亡作用,其中丹酚酸B盐可明显减轻小鼠急性肝损伤和肝细胞凋亡病理改变;而丹参其他成分,如二氢丹参酮Ⅰ,丹参酮ⅡA,丹参酮Ⅰ,丹参素钠则抗肝细胞凋亡作用不明显。

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