原儿茶酸通过A2a受体促进皮质神经元存活及突起生长

【摘要】：目的研究原儿茶酸(protocatechuic acid,PCA)对体外培养新生大鼠皮质神经元的神经营养作用及其初步的作用机制。方法 (1)体外无血清培养新生大鼠皮质神经元,采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP2)免疫化学染色法进行神经元鉴定;(2)体外培养新生大鼠皮质神经元,加入不同浓度PCA,用MTT法检测PCA16,32,64和128μmol·L~(-1)对皮质神经元的毒性作用,通过细胞形态学观察,培养液中乳酸脱氢酶(LDH)渗漏量的测定,有突起神经元数目与平均突起长度定量分析,MAP2,BDNF mRNA半定量分析以及MAP2 mRNA定量分析,观察原儿茶酸对皮质神经元的神经营养作用。(3)体外培养新生大鼠皮质神经元,应用相应的工具药K252a(Trk受体拮抗剂)、ZM241385(特异性腺苷A2a受体拮抗剂)、G(O|¨)6976(PKC抑制剂)、PD98059(MAPK抑制剂)及LY294002(PI3K抑制剂),观察它们对PCA促进皮质神经元的存活及突起生长是否有拮抗作用;采用免疫印迹法(Western blot)进一步检测p-Akt及Akt的表达水平。结果 (1)经两种不同的神经元特异性标志物(NSE和MAP-2)鉴定,确定所培养的细胞绝大多数为神经元;(2)不同浓度的PCA对皮质神经元的存活率没有影响,不具有细胞毒作用。与溶媒对照组相比,PCA 16,32和64μmol·L~(-1))的PCA组神经元细胞活力增强,LDH渗漏量减少,有突起神经元数目增多,神经元突起增长,MAP2,BDNF mRNA表达量增加,神经网络更发达,并有一定的量效关系。(3)PCA+ZM241385组和PCA+LY294002组有突起神经元数目和平均突起长度与PCA组相比均显著性减少,而与溶媒对照组相比均无显著性差异。PCA+K252a,PCA+G(O|¨)6976及PCA+PD98059组有突起神经元数目和平均突起长度与PCA组相比均无显著差异,与溶媒对照组相比均显著性增加。Western blot结果显示,PCA能明显增加新生大鼠皮质神经元Akt的磷酸化表达水平,而总Akt表达水平无明显改变;PI3K抑制剂LY294002能够抑制PCA诱导的新生大鼠皮质神经元的Akt磷酸化,而不影响总Akt表达水平。结论 PCA 16,32和64μmol·L~(-1)对新生大鼠皮质神经元具有神经营养作用;ZM241385与LY294002可以阻断其神经营养活性,而K252a,G(O|¨)6976及PD98059的阻断作用则不明显,说明PCA的神经营养活性作用是通过腺苷A2a受体活化间接激活Trk受体,从而激活下游的PI3K/Akt信号转导通路发挥作用的。