同时靶向PI3K/mTOR和微管的双重抑制剂的S9抗肿瘤作用

【摘要】：磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号失调在肿瘤发生发展过程中至关重要,而且,信号通路激活程度也是预后的重要指标,因此抑制该信号通路成为肿瘤靶向治疗的热点。目的:全面研究S9抗肿瘤作用的机制。方法:通过Westernblot和免疫荧光的方法研究S9对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响;在分子水平上利用酶活反应确认S9的直接作用靶标;流式细胞技术检测S9对细胞周期的影响;利用免疫荧光和体外聚合的实验检测S9对微管蛋白的影响;通过圆二色谱(circulardichroism,CD)和表面等离子共振技术(surface plasmon resonancetechnology,SPR)确证S9和微管蛋白的直接作用,并通过竞争结合实验确定S9的微管蛋白结合位点;运用分子模拟的方法预测S9和PI3Kp110a亚基、mTOR和微管蛋白的直接作用位点;采用磺酰罗丹明B(Sulforhodanmine B,SRB)法检测S9对各种来源肿瘤细胞包括耐药细胞株的增殖的作用;利用裸小鼠移植瘤模型检测S9的体内抗肿瘤作用。结果:S9能够有效拮抗EGF引起的PI3K信号通路的激活,下调包括Akt、mTOR、p70核糖体S6激酶(p70S6K)和起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平,以及细胞膜褶皱和Akt膜转位。进一步研究发现S9能够同时抑制PI3K和mTOR的激酶活性。与其他PI3K-mTOR通路抑制剂不同的是,S9能够明显阻滞细胞于M期。免疫荧光实验显示S9能够紊乱细胞中微管蛋白。分子水平实验揭示S9能够抑制微管蛋白的组装,引起微管蛋白二级结构的改变。SPR的实验显示S9能与微管蛋白直接结合,结合常数为11.1 M。S9与秋水仙素或长春碱类化合物的竞争实验表明S9作用于微管的秋水仙素结合位点。分子模拟的实验结果证实了多靶点特性:S9能够直接和PI3K p110、mTOR和微管蛋白直接结合。S9能够抑制多种来源的肿瘤细胞(包括单药耐药和多药耐药细胞株)增殖;并能快速地导致肿瘤细胞凋亡,对于人横纹肌肉瘤Rh30和肝癌细胞株SMMC7721的人癌裸小鼠移植瘤也有着较好的治疗作用。结论:国际上首次发现全新结构化合物S9同时靶向PI3K/mTOR和微管骨架,有效抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。因此,S9同时具有分子靶向药物和传统细胞毒类药物的作用特点,而分子靶向药物与新病毒药物的联合应用是目前肿瘤化疗中的一大趋势。S9抗肿瘤机理的系统研究为这类化合物进行进一步的结构改造提供了新的重要线索。