【摘要】：磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinaseB,PKB,又称Akt)-雷帕霉素靶体蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程,包括细胞增殖、凋亡、转录、翻译、代谢、新生血管生成以及细胞周期的调控。近年的研究表明,PI3K和mTOR的功能异常与肿瘤的发生发展有着密切的关系,已经被确认为抗肿瘤的重要靶点。目的:利用细胞模型,筛选得到了PI3K/mTOR双重靶向激酶抑制剂WJD008,并在分子和细胞水平对该化合物进行了药理学评价。同时,发现该化合物能抑制PIK3CA突变细胞株的增殖能力。方法:采用磺酰罗丹明B(Sulforhodanmine B,SRB)法检测WJD008对17种不同来源的肿瘤细胞增殖抑制作用。利用酶活反应(Kinase Assay)的方法检测WJD008对PI3K的激酶活性的影响。利用免疫沉淀(Immunoprecipitation)和酶活反应(Kinase assay)的方法检测WJD008对mTOR激酶活性的影响。运用蛋白免疫印迹(Western blot)的方法检测WJD008对细胞中PI3K-Akt-mTOR信号通路中关键蛋白,包括磷酸肌醇依赖激酶1(PDK1)、Akt、mTOR、p70核糖体S6激酶(p70S6K)和起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平的影响,同时间接检测了WJD008对同为磷脂酰肌醇-3激酶相关的激酶家族(phosphatidyli-nositol-3kinase-related kinase,PIKK)成员的共济失调毛细管扩张突变激酶(AtaxiaTelangiectasia Mutated,ATM)和DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependentprotein kinase,DNA-PK)的抑制作用。利用荧光成像方法检测WJD008对PI3K的抑制而导致的Grp1-PH蛋白结构域膜转位阻碍。利用流式细胞术(FACS)检测了WJD008对于细胞周期的影响。利用克隆形成(Clony Formation Assay)的方法检测了WJD008对于PIK3CA野生型和突变型细胞克隆形成能力的影响。结果:通过比较化合物对细胞增殖和PI3K-Akt-mTOR的抑制能力,从77个靶向PI3K-Akt-mTOR信号转导通路激酶抑制剂定向合成的化合物中,筛选得到化合物WJD008。WJD008能抑制PI3K(IC_(50)=1.72±0.66 nM)和mTOR的激酶活性。当浓度分别为1 M和0.3 M时,WJD008能明显下调人横纹肌肉瘤Rh30和人前列腺癌PC-3细胞中PI3K-Akt-mTOR信号通路中除PDK1外的其他相关蛋白的磷酸化水平,同时在浓度为1 M时就能抑制Grp1-PH蛋白在生长因子刺激下的膜转位效应。WJD008时间和浓度依赖性地将Rh30细胞阻滞于G1期。WJD008对于不同组织来源的肿瘤细胞增殖具有广泛的抑制作用:其中对于PC-3和RH30增殖抑制的IC_(50)分别为9.65 M和7.05 M。此外,WJD008对于PIK3CA突变细胞也显示出类似的增殖抑制作用。结论:WJD008是一个PI3K/mTOR双重靶向抑制剂,通过下调PI3K-Akt-mTOR通路的信号转导导致肿瘤细胞增殖抑制。