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脉冲磁场对白血病细胞HL60/ADR多药耐药的逆转效果及分子机制研究

韩英  刘晓秋  赵阿津  王琴  李进  
【摘要】:目的探讨脉冲磁场(pulsed magnetic fields,PMF)对白血病细胞HL60/ADR多药耐药的逆转效果及其可能的分子机制。方法细胞株及培养条件:急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60为阿霉素(ADR)敏感细胞株。HL-60/ADR为ADR诱导HL-60细胞建立的MDR细胞株。HL-60/ADR在含ADR 0.5ug/mL、体积分数为10%小牛血清RPMI 1640培养液中稳定生长。试验前2周换用无ADR的RPMI 1640培养液培养。细胞毒性实验:调整对数生长期细胞浓度为1×10~4个/mL接种24孔板,每孔1mL,实验分为对照组和实验组:实验组在150 Hz的PMF下照射1h,每隔24h取3孔进行细胞计数,取平均值,连续计数8d,对照组无PMF照射。细胞耐药及药敏实验:取2×10~5/mL的HL60和HL60/ADR细胞100μL分别接种于96孔培养板,常规培养24h,加入不同终浓度的阿霉素,终体积均为150μL,平行3孔。常规培养48h,加入MTT 40μL,4h后用酶标仪测出吸光度值A,得出IC_(50),实验重复3次。计算耐药倍数。药敏实验方法同上,实验组在频率为150Hz和250Hz,场强为40mT的PMF下照射30min和1h,以无PMF为对照,得出逆转倍数。流式细胞术测定细胞内药物蓄积浓度:实验分对照组和实验组,对照组为HL60,HL60/ADR,实验组为PMF照射组。加入1μg/μL的Rh123 1μL孵育1h、离心、PBS洗3次,流式细胞仪测定细胞内Rh123的相对荧光强度,以Rh123的相对荧光强度代表药物浓度。RT-PCR检测MRP mRNA的表达:实验分4组:对照组,单独ADR组,单独PMF组,PMF+ADR组。Trizol-步法抽提总RNA,RT-PCR参照试剂盒说明书。凝胶图像用BandScan软件进行分析。流式细胞术检测MRP1蛋白阳性表达率:PMF作用后收集细胞,冷PBS洗3次,多聚甲醛固定,兔血清封闭30min,加入FITC标记的鼠抗人MRP1单克隆抗体(单抗),4℃孵育30min,上机检测。统计学分析定量实验数据采用均数±标准差((?)±s)表示。用SAS统计分析软件包分析。实验组与对照组均数比较用t检验。结果单独PMF对HL60/ADR细胞的生长没有明显抑制作用,不同参数(频率为150Hz和250Hz,场强均为40mT,照射时间30min和1h)的PMF均能有效逆转HL60/ADR的多药耐药,150Hz/1h作用最为明显,逆转倍数为5.891倍。PMF作用后Rh123在HL60/ADR细胞内的蓄积增加了近8.0%,而MRP1基因表达下调了68.3%,蛋白阳性表达率下调23.6%。结论PMF能够通过下调MRP1基因和蛋白的表达,进而增加Rh123在细胞内的蓄积,功能性部分逆转白血病细胞的多药耐药,为辅助治疗白血病提供新的思路。

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