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一种可用於新药筛选的GFAT测定方法

葉菲  H.Maegawa  K.Morino  Kasiwagia  Kikgawaa  申竹芳  谢明智  
【摘要】:目的:建立一种可测定培养细胞内GFAT活性的高效、灵敏、简单的方法,该方法可用於新药的筛选。方法:在样品制作过程中,调整收集细胞的缓冲液、离心速度和蛋白含量;在GFAT活性测定过程中,降低总反应体积,优选了最佳底物浓度、反应时间、及测定波长,从而建立了可在96孔板上反应的高效、灵敏、简单的GFAT活性测定方法-GDH方法。并用该方法测定了3T3-L1、L6、HepG2、以及HIRc细胞等胰岛素靶细胞的GFAT活性,筛选了TPA,GFX,Firskolin,Wortmanin,PD,EGF,Glucosamine和Ortho-vanadate等在胰岛素信号传导系统中起重要作用的工具药对GFAT活性的影响。结果:6孔板培养的细胞可在96孔板上用GDH方法测定GFAT活性。在制样中加入GSH(5mM)和glucose-6-phophate Na_2(5mM)可保护酶的活性;样品的蛋白含量为80—150μg;测定波长为370nm;反应时间为90min;F-6-P、glutamine、APAD and GDH的最佳底物浓度分别为0.8mM,6mM,0.3mM和6U。3T3-L1、16、HepG2、以及HIRc细胞内的GFAT活性为1.001—3.796 nmol GlcN-6-P/mg protein/min。5 mM Ortho-vanadate刺激过夜,可显著降低L6肌管细胞内GFAT的活性;TPA,GFX,Firskolin,Wortmanin,PD,EGF及Glucosamine等药物对L6肌管细胞内GFAT的活性影响不明显。结论:GDH方法是一种可测定培养细胞内GFAT活性的高效、灵敏、简单的方法,该方法可用於新药的筛选。Ortho-vanadate对L6肌管细胞内GFAT的活性有一定的抑制作用。

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