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多重荧光定量幽门螺杆菌检测试剂盒

王盛洲  
【摘要】:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)是定植于胃粘膜表面的一种重要病原菌,与慢性胃炎、消化性溃疡、胃恶性肿瘤等疾病密切相关。幽门螺杆菌目前感染率很高,全球约半数人感染,但是仅有部分人出现消化性溃疡等症状,具体原因可能和幽门螺杆菌携带的毒力因子有关。幽门螺杆菌感染治疗中的重点则是对抗生素的耐药性,耐药性是导致幽门螺杆菌根除失败的重要原因。所以检测幽门螺杆菌的毒力基因和耐药基因在临床上有着巨大的应用前景。幽门螺杆菌的毒力基因最重要的是CagA(细胞毒素相关蛋白)和VacA(细胞空泡毒素)。Ca gA是幽门螺杆菌感染导致宿主产生炎性反应的重要效应蛋白,,是评价幽门螺杆菌毒力最重要的指标。VacA基因存在于所有的幽门螺杆菌菌株中,但只有50%的菌株表达VacA蛋白,VacA按照不同区域的分型可以用于鉴定HP的毒素活性。幽门螺杆菌耐药基因位点明确的有克拉霉素耐药基因23srRNA和左氧氟沙星gyrA喹诺酮类药物耐药性决定域。材料与方法:多重荧光定量RT-PCR技术由实时荧光定量RT-PCR技术上发展而来,通过选定多重荧光通道,在一个反应体系中加入多对引物和分别标记不同荧光基团的探针,实现对多种核酸模板的检测。本课题收集大量幽门螺杆菌临床样本,筛选CagA、VacA、23srRNA、gyrA的不同突变位点,设计多重引物和荧光探针,建立幽门螺杆菌同时检测毒力和耐药的体系标准。结果:毒力基因和耐药位点筛选和引物探针设计,设计6对引物、8条探针用于检测上述4个基因的不同位置的突变位点。单重PCR反应体系的建立,分别以构建出的不同突变HP质粒作为标准品,加入单一引物和探针,摸索出最佳反应条件。多重PCR反应体系的建立,优化确定多重PCR的组合,同时检测上述几种基因。多重反应体系特异性检测,以其他病原菌的DNA为模板,检测特异性。灵敏度的检测,通过梯度稀释检测混合体系中的灵敏度,最高灵敏度可达个位数。

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