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携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建

于洁  高书颖  
【摘要】:端粒酶与肿瘤发生和细胞衰老有关,利用分子生物学技术,将外源人端粒酶逆转录酶(human telomerase rcVcrse transcriptase,hTERT)基因导入低表达或不表达hTERT的细胞中,提高细胞内hTERT的表达水平,可以使某些类型的细胞永生化。本研究采用Gateway技术构建携带hTERT基因的重组慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-hTERT;将该载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测阳性细胞中外源hTERT基因的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响。经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒。重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞。结果表明,成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量,为进一步研究hTERT基因的功能及构建永生化细胞系奠定基础。

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