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农杆菌介导转化甘蔗系统优化

罗琼  姚丽  吴才文  朱祯  曾千春  
【摘要】:高光效C4作物甘蔗是重要的糖料和能源植物,其复杂的遗传背景导致传统方法改良甘蔗品种十分困难。农杆菌介导转化甘蔗可以较快地改良甘蔗的单一性状,但转化效率低获得可稳定遗传转化体相对较少。我们对该技术的一些改进提高了总体转化效率。首先将玉米核基质结合序列MAR添加在目标基因表达盒两侧,形成MAR-gene-MAR结构,以克服转基因的位置效应。nptⅡ为筛选标记,G418或巴龙霉素等抗生素筛选;混合菌液法准备浸染液;添加半胱氨酸等抗氧化剂对未成熟心叶或分生组织切段预处理后再农杆菌浸染;培养基中添加5.0μMCuSO_4,弱光照处理等提高甘蔗胚性愈伤组织和再生植株效率。在优化农杆菌转化甘蔗系统基础上,AGL1或LBA4404工程菌OD_(600)0.3-04遗传转化分生组织,21℃培养3天,Timentin抑制农杆菌,恢复培养14天,筛选2-3个月,分化植株1-2个月,植株移栽。比较了分生组织经愈伤组织诱导培养基CI_3培养0.5天、7天、28天、56天才农杆菌浸染的转化效率。共进行了3次试验,以外植体表面积相当于基因枪转化时每次枪击的面积为单位,每次试验每份材料10枪,共计120枪,总体转化效率为每枪1.5个转化事件。Southern blot、蛋白活性分析等在分子水平检测到外源基因的整合与表达。更为重要的是,改进的农杆菌转化甘蔗技术不需要菌体离心与重悬,分生组织等受体材料可以周年获得,为大规模转化获得足够大的育种群体并培育出基因工程甘蔗新品种提供了技术支撑。

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