先天性白内障致病基因的筛查及其生物信息学分析

【摘要】：目的在一常染色体显性遗传核性白内障的家系中筛查突变基因及探讨突变对基因结构和功能的影响。方法收集病人家系材料,应用裂隙灯对患者表型进行记录。采用蛋白酶K法提取家系成员23人(包括患者9人,非患者14人)的外周血基因组DNA。利用引物设计软件PRIMER PREMIERE设计特异性引物,使扩增片段涵盖与常染色体显性遗传先天性白内障相关的基因突变热点,进行靶片断的PCR扩增,这些相关的基因突变热点包括CRYAA,CRYAB,CRYBA1/A3,CRYBB2, CRYGC,CRYGD,GJA8,MIP,BFSP2,GJA3基因。将PCR产物测序,测序结果与GenBank发表序列进行比对分析.采用PCR-RFLP方法与PAGE电泳在200例正常对照和40例老年性白内障患者中对发现的突变位点进行验证检测。应用生物信息学软件Antheprot 5.0对致病基因及其突变体二级结构进行分析。应用Swiss-model程序进行野生型蛋白及其突变体立体结构的计算机建模。同时利用在线软件对其亲水性和等电点进行预测。结果测序发现在患者的CRYAB基因第一个外显子中发现第32位碱基发生了G→A的突变,此突变相应地导致了第11位氨基酸残基由Arg变成His(R11H)。RFLP验证表明家系所有患者的CRYAB基因均有此改变,而家系所有正常人的以及200例正常对照(包括40例老年性白内障患者)中未检出相同的突变。通过对人类,牛,鸡,鸭,鼠等的αB-晶状体蛋白比较发现该氨基酸残基在不同物种间高度保守。运用Antheprot 5.0对突变型和野生型的氨基酸序列进行比对,发现在NH_2-端突变型比野生型多出一个β-折叠。同源建模表明在突变位点相应位置蛋白表面的电势由正电变成负电,三级结构发生了改变。同时相应位置的亲水性降低,等电点由6.7变为6.5。结论在该四代人的常染色体显性遗传的核性白内障家系中发现了一个位于CRYAB基因上的R11H新突变。该突变导致αB-晶状体蛋白的结构及理化性质的改变,影响了其功能并最终导致白内障的发生。对建立遗传性白内障基因型-表型联系、进一步了解CRYAB基因的功能及其与白内障的关系、丰富人类白内障致病基因的突变谱具有重要意义,有助于开发新的诊疗方法从而阻止或延迟白内障的发生。