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黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)环氧化物水解酶PchEHA结构与功能关系的研究

张琳丰  李念  张义正  冯红  
【摘要】:环氧化物水解酶(Epoxide Hydrolases,EC 3.3.2.3)可催化环氧化物水解为相应的邻二醇, 因其在催化过科中对环氧化物具有对映体选择性,所以在化学合成工业和制药工业中具有潜在的应用价值。本研究在分析黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)环氧化物水解酶 PchEHA 和几种生物的环氧化物水解酶的氨基酸序列及模拟 PchEHA 三维结构的基础上。推测出 PchEHA 的活性中心位点、空间上邻近活性中心的位点和其他高度保守位点,利用定点突变获得了11个 PchEHA 的突变基因,并实现了其在外源宿主菌 E.coli BL21(DE3)中的表达。随后,对 PchEHA 野生型和11个突变酶进行了活性分析比较,其结果为:突变体 G36L 和 G65I 表达后不能正确折叠而几乎全为包涵体,PchEHA 野生型和其他9个突变体均为可溶性蛋白:以环氧苯乙烯作为反应底物分析酶活性,结果显示:突变体 D307G 与野生型的酶活性相近,突变体 N37W、D277E、W309A、D105E、H308K 的酶活性分别为野生型的81.3%、 56.4%、25.4%、16.2%、16.9%,突变体 H35P、Y159F 和 Y241F 的酶活性低于野生型的10%。根据氨基酸序列比对结果、三维结构同源建模和酶活性测定数据可得出以下结论:(1)与其他环氧化物水解酶相似,PchEHA 中包含保守的催化三联体 Asp105-His308-Asp277及与底物结合相关的 Tyr159、Tyr241,突变体 D277E 还保留50%以上的酶活性可能是因为 Asp 与 Glu 都是相似的带负电荷酸性氨基酸;(2)PchEHA 具有高度保守的 HGXP(35-38)基序,在空间结构上位于酶的表面,His35和 Gly36的改变严重影响酶的活性,表明与其他环氧化物水解酶一样,PchEHA 的 HGXP 基序具有稳定反应过程中形成的四面体中间物的功能:(3)空间上邻近活性中心的位点改变可能强烈改变酶的活性,如突变体 G65I 和 W309A,其原因可能是它们影响了底物与酶活性中心的结合。下一步将对 PchEHA 其他保守位点的功能以及高活性突变酶对外消旋环氧化物的对映选择性进行研究,以深入揭示 PchEHA 结构与功能的关系。

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