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慢病毒介导的人转铁蛋白转基因小鼠的研制及表观遗传修饰对其表达的影响

颜景斌  潘树标  郭歆冰  龚秀丽  蔡勤  张敬之  曾溢滔  
【摘要】:转铁蛋白(Transferrin,TF)是一种与铁结合的糖蛋白,在细胞生长、分化、增殖过程中起着十分重要的功能。因此,利用转基因动物生物反应器生产转铁蛋白在生物制药上具有重要的意义和前景。但是外源基因整合率不高和外源基因整合后表达水平不高一直影响转基因动物的发展。本文首先分别克隆了兔转铁蛋白启动子、增强子,并将其与人转铁蛋白小基因(包括 TF cDNA 及内含子Ⅰ)相连装入慢病毒载体 FUGW 中,构建了三种不同的表达载体 (RTF、EPTF 和2EPTF,而后通过小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒的方法制备转基因小鼠。实验结果显示共制备获得二种整合不同载体的转基因小鼠,分别命名为 FRTF、FEPTF 和 F2EPTF, 慢病毒介导的转基因小鼠制备方法不仅整合效率比原核显微注射高近3倍,达到32.4%,而且人转铁蛋向可在转基因小鼠血浆和乳汁中高效表达。同时我们对外源基因在小鼠各脏器中的表达模式进行了系统的研究,结果发现外源基因在转基因小鼠心脏,肝脏,脾脏,肺脏。肾脏,脑,睾丸(或卵巢)和肌肉中的表达水平存在差异,其中肝脏表达最高,肌肉几乎没有表达,这一结果与先前采用显微注射获得人转铁蛋白转基因小鼠基本一致。免疫组化及 HE 染色结果表明人转铁蛋白在肝脏、肾脏等各脏器中的表达不会影响小鼠的正常生理功能。基因的甲基化水平被认为是影响基因表达的重要因素。对兔转铁蛋白启动子进行分析发现,该启动子全长约250bp,存在一个明显的 CpG 岛,共有31个 CpG 位点。我们采用亚硫酸盐测序的方法对两只单拷贝整合的转基因小鼠(F1-949,F1-797)各脏器中外源基因表达水平和启动子甲基化程度进行了分析。实验数据显示在高表达的肝脏、低表达的心脏及不表达的肌肉中启动子平均甲基化水平分别为23.0%、59.0%和85.7%。对于同一个体,外源的人转铁蛋白表达水平与调控其表达的兔转铁蛋白启动子甲基化程度呈负相关,外源基因的组织特异性表达与启动子的甲基化密切相关。同时,对 F1-949,F1-797,F1-972三只小鼠的肝脏的甲基化程度进行分析发现,F1-949和 F1-797小鼠肝脏外源基因表达出较低的甲基化程度,分别有 20.4%和25.6%的 CpG 双联体被甲基化,而 F1-972小鼠肝脏外源基因有50.6%的 CpG 甲基化。不同小鼠肝脏外源基因甲基化程度差异较大,且与人转铁蛋白在不同个体肝脏中的表达水平呈反比。通过分析31个 CpG 位点的甲基化频率发现,表达越是高的脏器,越是明显存在二个相对甲基化程度较低的区域,第一个在第8个到第11个 CpG 双联体,第二个在第15到第19个 CpG 双联体,第三个在第25到第29个双联体。进一步的序列分析发现,这三个区域分别位于转录位点结合区 PRI,RNA 聚合酶结合区和 kozak 序列。说明这些位置的低甲基化可能和人转铁蛋白的高表达密切相关。

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