hTERT和TRF2双基因干扰对MOF-7细胞基因表达抑制及细胞凋亡影响的研究

【摘要】：人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶表达的限速因子,通过调节端粒酶活性,进而调节端粒的长度,以补充细胞在分裂过程中缩短的端粒从而维持细胞的生命。端粒重复序列结合因子2(telomeric repeatbinding factor 2, TRF2)是一种端粒相关蛋白,对端粒双链 TTAGGG 重复序列有高度亲和力,可以结合到双链序列和3,悬垂端的连接处,使单链的 G 尾插入到双链端粒 DNA 中而形成 T-Loop 结构,维持端粒的稳定,防止染色体发生丢失、重排、末端融合和被酶消化降解,从而保护染色体的完整性。本研究从端粒长度和端粒稳定性两方面入手,同时以 hTERT 和 TRF2为靶点,分别构建针对两基因的腺病毒载体介导的 siRNA 体内表达载体 rAd-hTERT 和 rAd—TRF2,将其单独和联合作用于人乳腺癌 MCF-7细胞,以实时荧光定量 PCR 检测各组 MCF-7细胞 hTERT 和 TRF2基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果显示(1)转染 MCF-7细胞48h 后,与 PBS 组相比,rAd-hTERT 可高效抑制 hTERT 基因 mRNA 的表达(抑制率约87%),对 TRF2基因表达无明显抑制(p0.05):rAd-TRF2可高效抑制 TRF2基因 mRNA 的表达(抑制率约80%), 对 hTERT 基因表达无明显抑制(p0.05):rAd-hTERT/rAd-TRF2联合干扰组 hTERT 基因的表达的抑制率约88%,TRF2基因的表达抑制率约85%,rAd-hTERT/rAd-TRF2联合干扰与 rAd-hTERT 和 rAd-TRF2分别干扰相比,对 hTERT 和 TRF2基因的表达抑制无显著差异(p0.05); rAd-HK 组、rAd-blank 组与 PBS 组相比,hTERT 和 TRF2基因表达抑制均无显著差异(p0.05)。 (2)rAd-hTERT 组、rAd-TRF2 组转染后1d 细胞凋亡率即开始升高,转染后第3～5d 凋亡最明显,第5d 达凋亡高峰:凋亡率 rAd-hTERT 组为46.2%,rAd-TRF2组为43.5%:第6d 凋亡率开始逐渐下降。而 rAd-hTERT/rAd—TRF2联合组转染后第1d 凋亡率为46.2%,第2d 为68.5 %,第3～6d 维持在较高水平,第6d达77.6%。联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比具有显著差异(p0.05)。而 rAd-HK 组、rAd-blank 组与 PBS 组相比,细胞凋亡率无显著差异(p0.05)。该研究证明在人乳腺癌 MCF-7细胞中,hTERT、TRF2基因表达无相关性:hTERT 和 TRF2单基因干扰均能有效抑制人 MCF-7细胞生长,促进凋亡,联合两基因干扰效果具有累加效应,说明联合干扰 hTERT 和 TRF2的肿瘤基因治疗比单基因治疗的效果更好, 可更大限度、更长时间的抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡。本实验为联合干扰端粒相关多基因的肿瘤基因治疗奠定了实验基础,研究结果表明该方法可望成为一种有效的肿瘤基因治疗新策略。