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Gap-LCR结合荧光定量PCR技术在低丰度DNA点突变检测中的应用研究

易萍  李力  俞丽丽  郑英如  郑秀惠  周元国  陈竹钦  
【摘要】:近年来研究发现在妊娠过程中母体血浆中存在游离胎儿 DNA,这一发现为基于母体外周血的无创性产前诊断开辟了新的领域。由于母体血浆总 DNA 量少,且在血浆总 DNA 中胎儿 DNA 所占的比例甚微,母体等位 DNA 片段可干扰胎儿 DNA 的检测,因此对这种低丰度胎儿 DNA 检测必须采用高灵敏度和高特异性的分析系统。空隙-连接酶链反应(gap ligase chain reaction,Gap-LCR)在低丰度基因单核苷酸差异检测方面具有很强的应用潜力。因此本研究拟以β地中海贫血的 CD17突变作为研究对象,在 Gap-LCR 的基础上结合荧光定量 PCR 来检测低丰度基因的单核苷酸差异,探索检测母体血浆中胎儿父系来源 DNA 点突变的新方法。1.为了更灵敏地检测连接产物,本实验对其中一对 LCR 引物进行修饰,分别于上游引物的5#61602; 端和下游引物的3#61602;端加入一段特异的序列,以此作为荧光定量 PCR 的识别序列,进行荧光定量 PCR 检测。采用 Gap-LCR 技术特异性识别突变位点,若样本存在要检测的突变,则产生连接产物,然后利用定量 PCR 技术对连接产物进行检测,就可达到检测低丰度 DNA 点突变的目的。2.将20 pg 和2 ng 的 CD17突变杂合子 DNA 标本分别进行15、20、25、30个循环的 LCR,结果发现随着循环数增加,其产物量也相应地增加,并提示用来检测母体血浆 DNA 标本时循环数可在20~25个之间进行选择。而利用200 ng 的正常 DNA 标本进行同样的循环梯度 LCR,结果发现尽管在 LCR 扩增过程中也可出现非特异性产物,但产物量明显低于20 pg CD17突变杂合子 DNA 标本相应循环数的产物量,由此提示,此方法用于低丰度 DNA 点突变的检测具有很高的灵敏度和较好的特异性。3.利用 Gap-LCR 结合荧光定量 PCR 技术检测含不同浓度 CD17突变的 DNA 标本:将含20 pg、200 pg、2 ng、20 ng CD17突变杂合子的 DNA 标本分别进行25个循环的 Gap-LCR,结果表明,LCR 起始模板量的增加10倍,其产物量大约增加10倍,由此提示,此方法具有较好的定量特性。4.将含20 pg 或200 pg CD17突变杂合子的 DNA 分别与1 ng、10 ng、100 ng 的正常 DNA 混合,作为 LCR 的模板。后分别利用 Taqman 探针法和 SYBR Green Ⅰ染料法定量检测 LCR 产物,结果表明,不同浓度背景 DNA 下的 CD17突变 DNA LCR 产物数量基本一致,由此提示该技术用于低丰度基因突变检测的灵敏度可达到 1:10000(突变 DNA 序列与正常 DNA 序列之比)。将 Gap-LCR 和荧光定量 PCR 技术相结合,成功地建立了一种高灵敏度的低丰度基因点突变检测技术,可用于母体血浆或血清中胎儿 DNA 点突变检测,同时可以对胎儿 DNA 进行定量,有望成为基于母体血浆中胎儿 DNA 的无创性产前诊断和妊娠期相关疾病预测的新手段。

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