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无选择标记和无载体骨架序列的转反义ACO1基因耐贮藏甜瓜的获得

哈斯阿古拉  郝金凤  牛一丁  高峰  张立全  扈廷茂  方天祺  
【摘要】:随着植物转基因技术的迅猛发展和转基因植物商业化应用速度的加快,转基因植物的安全性问题越来越受到人们的关注,其中选择标记基因和转基因表达载体骨架序列的安全性是人们关注的重要问题。本文以植物双元表达载体 pPZP221(GenBank 中登录号:U10491)为构建的最初载体,用 Pme Ⅰ和 Ase Ⅰ双酶切 pPZP221,去掉其 T-DNA 上的庆大霉素抗性选择标记基因 aacCl(gentamycin acetyltransferase gene),并在该位点插入 CaMV 35S 启动子和 nos 终止子序列。在该中间载体的 RB 和35S 启动子之间的 HindⅢ/Pst Ⅰ位点插入长约1kb 的烟草核基质附着区(MAR,GenBank 中登录号:AF373415),同法在 nos 终止子和 LB 之间的 EcoR Ⅰ位点插入该 MAR,选择插入方向正确的克隆。将甜瓜1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶1(ACO1)基因 cDNA 编码区第210至910个核苷酸序列反向构建到上述载体的 Xba Ⅰ和 Sac Ⅰ位点。用 Pae Ⅰ和 Psy Ⅰ双酶切 T-DNA 左右边界两侧的酶切位点,获得了无选择标记和无载体骨架序列、含有核基质附着区的反义 ACO1基因的线型表达盒(见图1)。电泳回收目的片断,回溶于0.1× SSC 溶液(pH 7.0),终浓度为0.1 n g/μL。应用本实验室已建立的甜瓜花粉管通道法转基因技术将目的 DNA 片段导入受体材料甜瓜品种河套蜜瓜。将河套蜜瓜种植于田间, 在盛花期进行人工自交授粉,授粉后于7至24h,切去柱头上端1/3部分,立即滴加1 0μLDNA 溶液。按常规方法进行田间管理,果实成熟后,按单果采收 T0代转化种子, 随机选取少量种子,进行 PCR 检测,选取阳性率高的 T0代种子,播种于田间,开花期进行人工自交授粉,挂牌标记授粉时间,当果实成熟时在田间筛选耐贮藏植株。因河套蜜瓜是典型的呼吸跃变型果实,果实成熟后在蔓上或采摘后一周左右完全软化腐烂,本研究根据此特性,当未转基因对照果实成熟后15天左右,根据耐贮性状对转基因果实进行筛选,从大量群体中筛选获得了8棵具有耐贮藏性状 T0代果实。检测结果表明 T0代果实的内源乙烯合成量为未转基因对照果实的1%至12%。在常温条件下转基因 T0代果实贮藏期为1至2个月,而未转基因对照果实贮藏期仅为1周左右。对 T1代植株进行 PCR 检测,结果表明被检样品均为阳性。通过本研究成功获得了无选择标记和无载体骨架序列的转反义 AC01基因耐贮藏河套蜜瓜,为进一步选育安全的转基因耐贮藏河套蜜瓜新品种奠定了基础。

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