热休克蛋白90抑制剂降低阿尔茨海默症β淀粉样肽的作用机制初步研究

【摘要】：研究热休克蛋白90的抑制剂——格尔德霉素(Geldanamyein,GA)对阿尔茨海默症中β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ)生成的影响,初步探讨 GA 降低 Aβ的作用机制。利用哺乳动物细胞表达载体 pCMV5,构建人β淀粉样肽前体蛋白 APP695(amyloid beta-protein precursor,APP)全长 cDNA,以及三种羧基端缺失不同序列的 APP695截短蛋白△NPXY、△YENP 和△ε的重组质粒。其中 NPXY 和 YENP 序列是 APP 内吞信号和与其他蛋白相互作用的重要序列,△ε是缺失了 APP 全部羧基端的截短蛋白。将上述四种重组质粒与绿色荧光蛋白 pEGFP 质粒共转染 CHO 细胞,利用 pEGFP 质粒带有的 neo 抗性基因,用1mg/ml G418筛选两周后将细胞单克隆化,并经 Western blotting 鉴定,建立相应的 CHO 细胞稳定表达细胞系。400nM GA 处理细胞22小时后,用人 Aβ40 ELISA 试剂盒检测四种细胞系上清中分泌的 Aβ量,同时 Western blotting 检测细胞总的 APP 表达量。为了验证 Hsp90抑制剂是否是通过激活热休克蛋白家族另一成员——Hsp70,影响细胞分泌 Aβ,将表达 Hsp70的质粒瞬时转染 CHO 细胞并进行检测。另外,还采用双荧光素酶报告基因系统验证了 GA 对 Aβ生成的影响。实验结果显示：(1)与阴性对照相比,400nM GA 处理22小时和过表达 Hsp70,均可降低四种稳定表达 CHO 细胞系(CHO/APP695、△NPXY、△YENP 和△ε)上清中的 Aβ量：其中 CHO/APP695细胞系的 Aβ量降低最明显。(2)Western blotting 检测细胞裂解液,显示 Hsp70表达可以使 CHO/APP695细胞株总 APP 表达量明显增多。(3)APP695截短蛋白的表达量不受 GA 处理和 Hsp70过表达的影响。另外,GA 处理可以显著下调细胞内 GSK3β表达量。我们认为 Hsp90抑制剂 GA 有可能是通过激活 Hsp70的表达,降低 Aβ产量,并且此过程可能涉及到 Hsp70与 APP 的相互作用。