重组腺病毒介导表达蓖麻毒蛋白B链及其与A链联合作用对细胞杀伤的研究

【摘要】：目的:用PCR的方法扩增了蓖麻毒蛋白A、B链基因(rta、rtb),将rtb 插入E1基因缺失腺病毒中,利用病毒启动子在肿瘤细胞中表达RTB蛋白,再注入原核表达及纯化的蓖麻毒蛋白RTA,由于RTA与RTB具有很强的亲和性,并借助重组腺病毒介导表达的RTB进入细胞,发挥RTA的细胞毒作用,对细胞产生杀伤作用。杀伤的细胞会释放RTA／RTB复合体,产生旁观者效应,杀伤周围细胞。方法:本研究用原核表达系统融合表达RTA,分离制备了有高生物活性的可溶性RTA蛋白,并构建了表达RTB的重组腺病毒载体。用重组腺病毒感染HEK293、 Hela、Smmc7721、HL7702等细胞,表达RTB,然后加入基因工程表达纯化的RTA 蛋白。用Trypan Blue染色法及MTT法检测RTA与重组腺病毒的联合作用对细胞的杀伤效果。结果:在HEK293、Hela细胞中,经Trypan Blue染色法检测,表达RTB的组都比的未表达RTB以及空细胞对照组的细胞死亡率要高,以0 μ L、10 μ L、 20 μ L、40 μ L的A链量梯度升高,最高差距可达50-60个百分点。在HeLa、 Smmc7721、HL7702三组细胞系,用MTT法检测细胞相对活性。表达RTB的组都比未表达RTB对照组的细胞存活率要低,其中加入40 μ L的组之间差距最大,明显低30-40个百分点。加入10 μ L的组差距也很明显,低20个百分点。各个细胞系也有差别。RTA蛋白的杀伤细胞作用提高了近2-3倍。通过重组腺病毒与RTA 联合处理的HeLa细胞上清对细胞的毒性作用证实,产生了一定的旁观者效应。这一研究为进一步的动物实验,和在此基础上构建特异性表达RTB的载体系统奠定了基础,为人类肿瘤基因治疗做了一些有意义的探索。