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出血性大肠杆菌O157:H7免疫磁性分离方法的建立

梁冰  纪雪  孙洋  祝令伟  刘军  周伟  郭学军  冯书章  
【摘要】:引言磁性纳米粒子是近几年发展起来一种新型材料,与免疫学相结合,广泛应用于病理、药理、分子遗传学和微生物等领域。尤其在免疫检测方面,逐渐受到重视。出血性大肠杆菌(EHEC)主要存在O157、O26和O111等几种血清型,其中主要以O157:H7为典型菌株,是一种动物源性传染病,牛和少数反刍动物为贮存宿主,对人有很强的致病力。本研究主要是建立一种灵敏性较高、特异性较好的分离O157:H7的免疫磁珠检测技术。材料与方法首先制备O157:H7单克隆抗体,并应用ELISA方法检测单克隆抗体效价。通过国内五种磁珠与国外两种磁珠的比较,优化磁珠与单克隆抗体的偶联条件,包括偶联时间、偶联温度和耦合缓冲液PH值等,选取最适磁珠和最佳偶联条件。磁珠与纯化后的单克隆抗体偶联制成O157免疫磁珠,通过测定偶联前后抗体蛋白浓度,计算磁珠蛋白偶联量。通过免疫磁珠捕获不同浓度的大肠杆菌O157:H7,利用涂板后计数,计算免疫磁珠的灵敏性;培养多种肠道常见菌株,与大肠杆菌O157:H7菌液等体积混匀,再进行免疫磁珠对混合菌液中目的菌的富集,然后将磁珠涂板于O157选择培养基,检测免疫磁珠的特异性。结果与讨论通过五种磁珠的比较,选取国内倍思乐羧基磁珠(直径0.5~1μm)。偶联条件为在振荡器上磁珠悬浮液37℃孵育2h,耦合液PH为7.4。通过免疫小鼠获得腹水,制备大肠杆菌O157:H7单克隆抗体效价达1:1.024×10~4;制备单抗免疫磁珠对大肠杆菌O157:H7的特异性好,捕获效率因细菌浓度的不同,捕菌效率也不同。在1.4×10~4CFU/mL细菌含量,磁珠的吸附率为53%;在1.4×10~2CFU/mL细菌含量,磁珠的吸附率为83%。大肠杆菌O157:H7细菌含量在1.4×10~4CFU/mL时,特异性集菌率为90%;在1.4×10~3 CFU/mL时,特异性集菌率为43%,而在140 CnU/mL时,特异性集菌率仅为7%。结论大肠杆菌O157:H7在人类感染疾病中的地位越来越突出,很多实验室对其检测方法都已进行深入研究。本研究通过制备单抗免疫磁珠对大肠杆菌O157:H7进行富集,具有较高的特异性和灵敏性,建立免疫磁珠富集鉴定大肠杆菌O157:H7的方法具有可行性。

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