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海兰灰蛋鸡粒细胞巨噬细胞集落素刺激因子的毕赤酵母表达及活性鉴定

王黎霞  张鹏  安健  
【摘要】:在控制鸡病的方法中,基因工程疫苗以独特的优势具有广阔的前景,但免疫原性差的缺点极大地限制了其实际应用,免疫学研究认识到细胞因子在免疫反应中发挥着重要的作用。本研究对海兰灰蛋鸡GM-CSF基因序列进行克隆和信号肽预测,PCR技术去掉信号肽序列,改造了CDS 3'端的终止密码子,使C末端带有c-myc和6His抗原标签,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA,BstXI酶切线性化,电转化感受态GS115酵母细胞,高浓度Zeocin的YPD平板上筛选阳性酵母菌落并PCR鉴定,BMMY培养基中摇瓶培养,甲醇诱导表达,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,鸡GM-CSF表达成功,在3到4天BMMY培养基中分泌表达的浓度达到高峰,对表达鉴定成功的菌株进行大规模诱导表达,离心收集表达上清,经超滤离心浓缩,用His Bind Ni-NTA层析柱进行纯化,获得纯度较高的重组鸡GM-CSF,淋巴细胞增殖实验结果表明,酵母表达的鸡GM-CSF具有较强的促进淋巴细胞增殖的功能。

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