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少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶全长基因的克隆与序列分析

王俊伟  孟庆玲  乔军  王为升  
【摘要】:利用寄生性线虫的天敌——捕食线虫性真菌对家畜寄生性线虫进行生物防治是一种非常有潜力的寄生虫控制模式,对发展无污染的绿色畜牧产品有重要意义。少孢节丛孢菌是捕食线虫性真菌中的代表种之一,该菌在侵染线虫过程中借助分泌的胞外蛋白酶促进菌丝对线虫体壁的直接穿透。丝氨酸蛋白酶(Aoz1)被认为少孢节丛孢菌分泌的一种重要的胞外蛋白酶,在其穿透线虫体壁与消化宿主器官的过程中发挥着重要作用。本研究根据已经报道的少孢节丛孢菌Aoz1基因序列,设计特异性引物,通过PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株(XJ-XA)Aoz1基因序列进行了扩增,并与国内外少孢节丛孢菌不同地域分离株相应序列进行了同源性分析,构建该基因系统进化树。结果显示,XJ-XA Aoz1基因全长为1344 bp,包含两个外显子和一个63 bp的内含子(第517~579位核苷酸)。该基因编码426个氨基酸,信号肽位于序列的第1~21氨基酸,其分子量为44.4kDa。XJ-XAAoz1前肽切割位点在分泌性蛋白的N末端之前,且前肽的最后一个氨基酸残基是位于序列第123位的酪氨酸(Y)。氨基酸序列的第160~171位是天冬氨酸(D,第164位)活性位点所在位置,第200~210位是组氨酸(H,第203位)活性位点所在位置,第351~361位是丝氨酸(S,第353位)活性位点所在位置,表明该酶属于Subtilase家族。成熟的XJ-XAAozl丝氨酸蛋白酶序列包括303个氨基酸,分子量为31.4kDa,包括2个潜在的N末端糖基化位点(第178-180氨基酸,第252-254氨基酸)和2个与底物结合的S1区(SBP)包括Ser_(25)9Leu_(260)Gly_(261)和Ala_(285)Ala_(286)Gly_(287)。XJ-XA Aozl基因与少孢节丛孢菌瑞典株(X94121)和云南株(AF516146)Aozl基因核苷酸的同源性分别为97.5%和98.3%,但与其他捕食线虫性真菌Aozl基因存在差异。系统发生分析发现,少孢节丛孢菌不同地域分离株Aozl基因序列具有较高的亲缘性,与其他捕食线虫性真菌Aozl基因亲缘性较远。本研究为研发绵羊线虫病生物防控制剂奠定了前期基础。

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