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Molecular characterization of an insulin receptor-encoding gene,Hc-daf-2,from the parasitic nematode Haemonchus contortus

Lok JB  Gasser RB  Campbell BE  Sandeman MR  
【摘要】:正Insulin-like signaling pathway regulates whether animals enter the reproductive life cycle or arrest development at the long-lived dauer diapause stage in free-living nematode Caenorhabditis elegans. Daf-2,a key gene in the insulin-like signaling pathway that mediates the development and reproduction, encoding an insulin receptor family member.It is postulated that parasitic nematode life-span regulation by insulin-like signaling is analogous to free-living nematode Caenorhabditis elegans.In the present study, we used a genomic approach to determine the structures of daf-2 orthologues(designated Hc-daf-2) and their transcriptional level,a full-length cDNA inferred to encode an ortholog of daf-2 was isolated from the parasitic nematode Haemonchus contortus.The full-length cDNA sequence of Hc-daf-2 was 5462bp in length containing a 5'-UTR of 697bp,a 3'-UTR of 550bp and 4215 bp of protein-coding region,encoding a protein of 1405 amino acids.The BLASTx analyses revealed that the predicted protein sequence had 48- 63%identities/similarities to daf-2 ortholog of Ascaris sum,Brugia malayi,Loa loa,C.elegans, Parastrongyloides trichosuri and Trichinella spiralis.Comparison of Hc-DAF-2 with predicted amino acid sequences of daf-2,insulin receptor of human and Drosophila found that Hc-DAF-2 has a putative signal peptide,a cysteine-rich region in the putative ligand-binding domain,a proteolysis site,a transmembrane domain and a tyrosine kinase domain.Phylogenetic trees constructed based on predicted amino acid sequences of Hc-DAF-2 and daf-2 ortholog from other 27 animal species including 7 nematode species for which full-length cDNA sequences are available in GenBank showed that Hc-DAF-2 is grouped with strong bootstrap support(99%) within nematode cluster excluding from non-nematode species. Transcriptional analysis by RT-PCR detected the transcriptional expression of Hc-daf-2 in all developmental stages and both sexes of H.contortus including egg,L1,L2,L3,female L4,male L4, female adult and male adult.For studies of cross-species complementation,the putative rescuing plasmid vectors,containing the coding region of Hc-daf-2 and Ce-daf-2,respectively.In brief,Hc-daf-2 and Ce-daf-2 were cloned into Ppvl99,Ppv238 with GFP removed,creating four vectors used in genetic complementation studies.This study provides the first insight into an insulin receptor-encoding gene of parasitic nematodes and a sound basis for future functional genomic work.

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