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新孢子虫顶膜抗原1结构域的表达与免疫保护作用研究

崔霞  杨道玉  雷涛  张玉华  刘群  
【摘要】:本文旨在对新孢子虫的顶膜抗原1(Apical membrane proteinl)各结构域进行分段克隆、表达,筛选出免疫原性较强的结构域构建真核表达载体,以进一步分析其免疫保护作用。经生物信息学软件分析NcAMAl的外功能区包含有三个结构域DⅠ、DⅡ和DⅢ。本研究以新孢子虫mRNA为模板分别扩增NcAMAlDI、NcAMAl.DⅡ和NcAMAlDⅢ的基因序列,亚克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-DⅠ、pET28a-DⅡ和pET28a-DⅢ。各重组质粒在表达菌诱导表达、纯化后分别于第0、2、4周免疫小鼠,三免后两周采血,分离血清,ELISA检测抗体水平,各免疫组均获得了较高滴度的抗体,其中rNcAMA1DⅡ免疫组抗体滴度最高,可达10~5。免疫血清进行体外新孢子虫入侵Vero细胞抑制试验,将免疫血清与纯化的Ncl速殖子37℃共孵育1h,接种到单层生长的Vero细胞,孵育1h后,用PBS洗去未入侵的速殖子,继续培养30h后观察新孢子虫入侵情况。结果显示,anti-rNcAMAlDⅠ和anti-rNcAMAlDⅡ与对照组相比均能有效抑制虫体的入侵,抑制率分别为45.18%和52.77%。NcAMAlDⅡ更能有效阻断虫体入侵,在此研究基础之上,将NcAMAlDⅡ克隆真核表达载体pcDNA3.1,构建质粒pcDNA-DⅡ。将该质粒体外转染HEK293细胞,经间接免疫荧光检测能被新孢子虫多抗识别,说明NcAMAlDⅡ可以在真核细胞表达有活性的蛋白。将质粒pcDNA-DⅡ于第0、2、4周,经肌肉注射BALB/c小鼠,通过淋巴细胞增殖试验、抗体滴度检测以及细胞因子检测来评价免疫效果。与对照组相比pcDNA-DⅡ能刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体;体外淋巴细胞增殖实验结果表明免疫组小鼠的淋巴细胞经全虫抗原刺激增殖明显;IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10的表达水平显著增加,说明pcDNA-DⅡ可以刺激小鼠产生较强的体液免疫应答反应和细胞免疫应答反应。

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