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新孢子虫IMP1基因的克隆、表达及蛋白定位的初步研究

崔霞  雷涛  杨道玉  郝攀  刘群  
【摘要】:本文旨在对新孢子虫Immune mapped protein-1(IMP1)基因进行克隆、表达及亚细胞定位研究。IMP1是2011年在巨型艾美耳球虫内发现的一类具有免疫保护性的蛋白,但该蛋白的分泌来源、去向和功能尚不可知。已有的研究表明,IMP1在顶复门原虫高度保守,通过生物信息学分析在新孢子虫基因组中筛选到和巨型艾美耳球虫IMP1具有高度相似性的NCLIV 040030基因(将该基因定名为NcIMP1)。本研究以新孢子虫Nc1株为研究材料,对NcIMP1基因进行扩增、测序和结构分析;将NcIMP1基因亚克隆至原核表达载体pET28a,在表达菌中诱导表达。重组蛋白NcIMP1经纯化后免疫小鼠,制备特异性多抗。通过间接免疫荧光的方法,对该基因进行亚细胞定位,并构建重组质粒pdxf-NcIMP1,以GFP为报告基因实时观察IMP1在新孢子虫速殖子的分布情况。研究结果显示:该基因全长3067bp,包含有3个内含子和四个外显子,开放阅读框为1182bp,编码一条393个氨基酸的多肽链,分子量约为43kDa。NcIMP1蛋白有多个蛋白基序,包括9个酰基化位点、14个磷酸化位点以及2个糖基化位点,该氨基酸序列不具有明显的信号肽和跨膜区。重组蛋白免疫小鼠后得到高滴度的特异性抗体,间接免疫荧光技术对NcIMP进行定位显示NcIMP1定位于新孢子虫速殖子表膜上;以GFP为报告基因对NcIMP在虫体分布情况进行实时观察显示,该蛋白在新孢子虫速殖子阶段持续表达。本研究成功获得了新孢子虫的IMP1蛋白的基因序列,对其的表达、鉴定及定位的初步研究,为该蛋白功能研究提供了有效资料和数据。

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