福寿螺多功能纤维素酶基因egx的克隆及其体外功能表达

【摘要】：【目的】克隆福寿螺多功能纤维素酶基因egx,并在大肠杆菌和哺乳动物细胞中进行表达分析。【方法】通过RT-PCR的方法,从福寿螺胃组织total RNA中克隆福寿螺多功能纤维素酶egx基因序列,连接到克隆载体pMD18-T,再通过EcoRⅠ和NotⅠ两个酶切位点分别与表达载体pET-32a(+)及pcDNA3.1(+)连接,构建原核、真核表达载体,并在E.coli BL-21(DE3)和猪肾细胞PK15中进行表达,最后采用DNS法测定表达产物酶学活性。【结果】测序结果表明,RT-PCR扩增得到1326 bp的序列,包括1185 bp的编码序列和部分侧翼序列,编码序列与已报道的福寿螺多功能纤维素酶基因cDNA序列相似性为99%,氨基酸序列相似性为100%。原核细胞表达产物经包涵体复性后,对羧甲基纤维素钠、2-羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、微晶纤维素、木聚糖的水解活性分别为:24.78U/mg、15.67U/mg、18.42U/mg、600.91U/mg、175.43U/mg;而在PK15细胞中重组酶对以上五种底物的活性分别为:0.84U/mL、0.78U/mL、1.01U/mL、14.62U/mL、4.23U/mL。【结论】克隆了福寿螺多功能纤维素酶基因,并成功在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达,为福寿螺多功能纤维素酶的深入研究及广泛应用奠定了基础。