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有效避免干扰素反应的RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动表达长dsRNA的RNAi载体的设计、构建及初步验证

孙朕  樊宝良  
【摘要】:目的本研究欲使RNA聚合酶Ⅱ启动子表达的RNA停在细胞核内,为将来应用组织特异性RNA聚合酶Ⅱ启动子表达长dsRNA而有效避免干扰素反应生产组织和发育阶段特异性沉默特定不利基因的家畜品种奠定基础。方法以pCDNA3.1(+)载体为基本骨架,在其转录单元5'端和基因编码序列的3'端各添加了一个能够自剪切核酶将5'帽子和3'polyA尾切除使转录后的RNA停在细胞核内折叠形成长dsRNA,而不进入细胞质。将eGFP报告基因插入到该载体的两个核酶之间,用于对该载体进行初步的检测。同时构建了一个表达绿色荧光蛋白基因的正常对照载体和一个排除因转染效率差异而影响各组绿色荧光蛋白表达的红色荧光蛋白表达载体。最终通过瞬间转染对荧光蛋白表达情况进行观察以及通过半定量RT-PCR检测各组细胞质中eGFP的mRNA含量差异,而对该载体进行初步判断。结果在以红色荧光指示绿色荧光转染效率基本一致的情况下,对照组能观察到绿色荧光,而实验组观察不到绿色荧光,初步显示实验组的RNAi载体能达到预期效果。半定量RT-PCR结果显示实验组细胞质中eGFP的mRNA含量比对照组下降了46.1%,说明该RNAi载体虽没有达到预期的理想效果,但还是取得了一定的效果。

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