利用单胚胎抑制消减杂交技术筛选猪MⅡ期卵母细胞转录本的研究

【摘要】：【目的】本研究旨在联合SMART(switching mechnanism at 5' end of RNA transcript)和T7体外转录技术,建立单细胞体外转录体系;在此基础上,利用抑制消减杂交(SSH),筛选猪卵母细胞MⅡ特异转录本。【方法】通过设计特定SMART引物3'SMART CDS PrimerⅡA和SMART7ⅡA Oligonucleotide,对猪单个体外成熟培养的MⅡ期卵母细胞和桑椹胚的mRNA进行逆转录,以5'PCR PrimerⅡA为引物进一步合成双链cDNA(ds cDNA);以SMART扩增的ds cDNA为模板,利用T7体外转录技术进行体外转录合成aRNA,以aRNA为模板,3'SMART CDS PrimerⅡA和SMARTⅡA Oligonucleotide为引物进行逆转录,以5'PCR PrimerⅡA为引物进一步合成ds cDNA;以aRNA合成的ds cDNA为材料,猪MⅡ期卵母细胞作为tester,猪桑椹胚作为driver,进行SSH,筛选MⅡ期卵母细胞差异表达转录本。【结果】联合SMART技术和T7体外转录技术进行体外转录,获得的体外扩增转录本aRNA浓度达到1.962μg,基本能满足高通量筛选的需要;在单个胚胎体外转录基础上,通过SSH,成功获得21个ESTs;进一步blastx-nr和GO分析发现,这21个转录本广泛参与了DNA修复、DNA复制、细胞周期、DNA甲基化等多种生物过程。【结论】本研究的结果说明利用单个细胞进行SSH是可行的。结合单细胞分离技术,本研究建立起来的技术体系为大型哺乳动物早期胚胎发育机理的研究及人类早期胚胎的临床诊断的研究提供了一个有效的平台。