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猪细胞色素P450 3A亚族基因的克隆及表达

曹湛  司红彬  武力  向蓉  曾振灵  
【摘要】:【目的】细胞色素P450(CYP450)是药物代谢过程中的关键酶,机体90%以上的药物代谢都要通过肝CYP450。CYP450于1958年被发现以来,就引起了人们的广泛重视,其分布广泛、结构多样、种属间的差异及其基因的多层次调控让CYP450的生物功能表现出其复杂性及重要性。为了深入了解CYP450的结构与功能,本文进行了猪CYP450 3A亚族基因的克隆及原核表达研究,为研究该基因的结构及功能关系建立了初步的基础工作。这部分工作将有利于利用表达的融合蛋白,制备免疫抗体,以建立免疫组化方法等,同时可以通过纯化蛋白,在P450氧化还原配体存在的条件下,重建体外单加氧酶系统,进一步了解CYP450的酶活性及底物特异性,从而明确CYP450基因的结构功能关系。【方法】根据细胞色素P450 3A亚族基因的保守序列设计引物,应用RT-PCR技术,从猪的肝脏组织中克隆了一条细胞色素P450基因的EST片段,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术。以EST片段的序列信息为基础,通过巢式PCR,从而获得细胞色素P450 cDNA的全长基因信息,将所得CYP3A亚型基因通过NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点插入pColdTF中,所得重组质粒pColdTF-CYP3A4转化至E.coli Rossetta,20℃、0.5mmol/L IPTG的诱导下进行表达,SDS-PAGE检测表达结果。【结果】所获得细胞色素P450 cDNA的全长基因信息显示:从猪肝脏组织中获得的cDNA全长为1804bp,其中编码基因1512bp,编码504个氨基酸,这个P450基因具有细胞色素P450的特征区域如膜锚定信号区、螺旋I、螺旋K及血红素结合区等,氨基酸序列比对表明,所得CYP亚型与其它真核生物细胞色素P450的3A亚族的氨基酸序列同源性55%,根据命名法则命名为CYP3A,跟人类的CYP3A4的同源性为74.8%,其中108位Phe,210位Leu,212位Arg,304位Phe等关键位点高度一致。SDS-PAGE检测显示,表达的融合蛋白分子量约为112kDa,目的蛋白总表达量随着OD_(600)值增加随之增加。而在OD_(600)=0.4的条件下加入IPTG,可以在上清里获得较多可溶性蛋白,结果显示在20℃,OD_(600)=0.4时加入IPTG诱导12h更有利于目的蛋白在上清表达。【结论】本实验获得的基因属于CYP3A亚族,与人类的CYP3A4同源性较高,低温利于本基因的可溶性表达,本实验将有利于进一步了解该CYP3A亚型基因的结构功能关系。

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