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牛分支杆菌与结核分枝杆菌基因芯片检测探针的筛选

林志雄  贾坤  罗长保  鱼海琼  陈茹  赵吟  谢凯英  李守军  
【摘要】:结核病是常见的人兽共患细菌性传染病之一,给人类的健康以及畜牧业的发展带来了严重的危害。牛结核病被世界动物卫生组织列为B类疫病,是进出境检验检疫中重点检疫的动物疫病之一。且牛分枝杆菌还可以通过牛奶等途径感染人,因此对牛分枝杆菌及结核分枝杆菌的快速检测具有重要的公共卫生学意义。材料方法:根据Gen-Bank和相关文献,选择牛分枝杆菌和结核分枝杆菌相对保守且特异的核酸序列应用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件各设计一对引物:PTBF:5'-CAA CGG GTG GCTCAA GT-3',PTBR:5'-CTC GGT CTG GGT TTT CG-3';PMBF:5'-CTC AGC TGG TCA TGT TCG CGAT-3',PMBR:5'-CGG TGT GCC GGA GAA GCC G-3'。其中下游引物的5′端用荧光素Cy3标记修饰,目的基因扩增产物理论值为234bp和294bp。针对该目的基因扩增产物的序列,各设计4条备选探针,探针的核苷酸序列与PCR产物带有荧光的反向链互补,3′端氨基修饰,设计质控探针(QC)作为矩阵标志物,5′端经氨基修饰,3′端HEX标记。探针和引物序列经BLAST分析确定其特异性。将标记的探针点至醛基化基片,制备基因芯片。采用引物不对称比例法PCR技术为基础,扩增目的片段,然后将单链扩增产物与芯片杂交,杂交信号经扫描仪扫描后进行数据判读。实验结果:所设计引物能够将目的片段有效扩增,筛选出的2条探针对阳性质粒进行实验性检测,能够有效的将两者区分,同时,芯片杂交图谱差异不显著,具有良好的重复性。基因芯片是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面,并以此作为探针,在一定的条件下,与样品中待检测的靶基因片段杂交,通过检测杂交信号,实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测,其优势是高通量、快速,特异性好,另外,采用基因芯片的方法无需机体免疫应答反应,可以早期、准确地检测病原,这对于预防、控制疫情的扩散十分重要该研究有望为进出境动物疫病快速、高通量基因芯片检测技术的建立奠定基础,具有广阔的应用前景。本研究采用基因扩增技术,选取结核分枝杆菌以及牛分枝杆菌的特异序列并对其进行扩增,然后针对特异序列的不同位置,设计多条探针,通过BLAST数据库进行在线比较,对设计的探针特异性进行初步筛选,以确保所设计探针的特异性,针对每种菌各选定4条备选探针进行试验,通过杂交试验,最终确定pt1、pm1做为检测探针。该检测探针的筛选,为建立基因芯片检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,提供了重要的依据。通过进一步的研究,有望开发出基因芯片鉴别诊断牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的新实验方法。

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